产品内容

提取液：提取液 50 mL×1 瓶，在 4℃保存；

试剂一：液体 40 mL×1 瓶，在 4℃保存；

试剂二：粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 250μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存； 试剂三：粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 300μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明

MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草 酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着 重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不 同的辅酶特异性，MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH， NADP-MDH 主要存在于 真核细胞中。 NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降。

自备仪器和试剂 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水

操作步骤

一、 粗酶液提取：

细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置 冰上待测。 血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置于 37℃水浴中预热 30min 以上（保证无沉淀）。

3、操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，充分吹打混匀后立即记录 340nm 波长下初始吸 光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，计算 ΔA 空白=A1 空白-A2 空白，ΔA 测定=A1 测定-A2 测定，计算 ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。

三、NADP-MDH 活力单位的计算： 

1、血清（浆）NADP-MDH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH（U/mL）=ΔA÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T×109 =6430×ΔA ε：NADPH 消光系数，6.22×103 L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.0008L； V 样：加入样品体积，0.02mL；T：反应时间，1min。

2、组织中 NADP-MDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T×109 = 6430× ΔA ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH（U/g 鲜重）=ΔA÷ε÷d×V 反总÷（W×V 样÷V 提取）÷T×109 = 6430 × ΔA ÷W ε：NADPH 消光系数，6.22×103 L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.0008L； V 样：加入样品体积，0.02mL；V 提取：提取液体积，1mL；W：样本鲜重，g；Cpr :样本蛋白浓度， mg/ml；T：反应时间，1min。

3 细菌或培养细胞中 NADP-MDH 活力的计算:

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单 位。

NADP-MDH（U/104 cell）=ΔA÷ε÷d×V 反总÷（200×V 样÷V 提取）÷T×109 =13 × ΔA ÷W ε：NADPH 消光系数，6.22×103 L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.0008L； V 样：加入样品体积，0.02mL；V 提取：细胞提取液体积，0.4mL；200：200 万细胞；T：反应时 间，1min。

注意事项

 1、粗酶液的提取必须在 0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

 2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一 37℃放置。

 3、建议一人加样一人比色。尽量保持反应温度为 37℃。

 4、空白管测 1-2 管即可。