猪外周血淋巴细胞分离液试剂盒说明书 

规格：3×200 mL/kit 
保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期 2 年。无菌开封后，保存于室温。
组成： 各种动物外周血淋巴细胞分离液 200mL 全血及组织稀释液 200mL 细胞洗涤液 200mL 
产品简介： 本产品是一种用于分离动物外周血淋巴细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。其分离原理是根据血 细胞的密度差异，通过离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将淋巴细胞从外周血中分离出来。适用 于从动物抗凝血液中分离淋巴细胞，无菌条件下分离的淋巴细胞可用于培养。 本品仅供科研使用。 
操作步骤：

 1. 取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液 或者PBS稀释全血。

 2. 在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL，加入等体积 分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离 液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液 上，因为两者的密度差异，将形成明显的分 层界面。如果样品较多加样时间较长，在离 心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。）

 3. 室温，水平转子500~1000g，离心20~30min （血液的体积越大所需的离心力越大，离心 时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转 速最大不超过1200g）。

 4. 离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的 血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分 离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管 底部是红细胞与粒细胞。

 5. 小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心 管中， 10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层 细胞。250g，离心10min。

 6. 弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。

 7. 重复步骤6

 8. 弃上清，细胞重悬备用。

注意事项：

A. 开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。 

B. 分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条 件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 

C. 血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2 h以内），为保持淋巴细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 

D. 稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞 得率及纯度。 

E. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁影响分离效果。 F. 血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离 条件。 G. 吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加；吸取 过多的血浆层可能会导致淋巴细胞中血浆蛋白及血小板污染。 H. 如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。 I. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液 的比重、动物种属及被分离细胞的名称。

参考文献
1. Boyum A. Separation of leucocytes
from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968; 97: 7. 
2. TingA, Morris PJ. A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood. Vox Sang. 1971 Jun; 20(6): 561-3.
3. Boyum A. Separation of Blood Leucocytes, Granulocytes and Lymphocytes Tissue Antigens. 1974; 4(4): 269-74. 4. Weisbart RH, Webb WF, Bluestone R, Goldberg LS. A simplified method for lymphocyte separation. Vox Sang. 1972; 23(5): 478-80. 
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 参考文献： 《An alternative pathway of enteric PEDV dissemination from nasal cavity to intestinal mucosa in swine》 作者:Yuchen Li, Qingxin Wu, Lulu Huang, Chen Yuan, Jialu Wang & Qian Yang  期刊:Nature Communications 影响因子:11.878 PMID:30232333 《Interferon as a Mucosal Adjuvant for an Influenza Vaccine in Pigs》 作者:Lirong LiuWenhui FanHe ZhangShuang ZhangLiang CuiMeng WangXiaoyuan BaiWenxian YangLei SunLimin YangWenjun LiuEmail authorJing Li 期刊:Virologica Sinica 影响因子:2.467 PMID:30989429 《Generation of porcine monoclonal antibodies based on single cell technologies》 作者:Kongpan Li,Jianhui Bai,Lijuan Du,Xifeng Wang,Cuncun Ke,Wei Yan,Changqing Li,Liming Ren,Haitang Han.Yaofeng Zhao 期刊:Veterinary Immunology and Immunopathology 影响因子:1.846 PMID:31420069 《Immunogenicity and protective efficacy of recombinant proteins consisting of multiple epitopes of foot-and-mouth disease virus fused with flagellin》 作者:Baofeng Cui,Xinsheng Liu,Peng Zhou,Yuzhen Fang,Donghong Zhao,Yongguang Zhang,Yonglu Wang 期刊:Appl. Microbiol. Biotechnol. 影响因子:3.67 PMID:30888465 《Effect of route of inoculation on innate and adaptive immune responses to porcine epidemic diarrhea virus infection in suckling pigs》 作者:Yingshan Zhou,Cong Chen,Yunlu Chen,Ziqi Liu,Jingyou Zheng,Tingjun Wang,Hao Luo,Yajie Liu,Ying Shan, Weihuan Fang,Xiaoliang Li 期刊:Vet. Microbiol. 影响因子:2.791 PMID:30593385