Caspase-6活性测定试剂盒

品牌：Solarbio | 货号：BC3860

商品货号：	商品品牌：	规格	基本售价：
BC3860-20T	Solarbio	20T	624.00元
BC3860-50T	Solarbio	50T	1104.00元
BC3860-100T	Solarbio	100T	1904.00元

保存：试剂常温运输，到达后按要求储存，1 年内稳定。

Caspase-6活性测定试剂盒 100T产品内容：

1. 裂解缓冲液 4 ºC 保存；

2. 反应缓冲液 4 ºC 保存；

3. 底物 -20 ºC 避光保存；

4. 10 mM pNA 标准品 -20 ºC 避光保存。

Caspase-6活性测定试剂盒 100T产品介绍：

Caspase 是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含 10 多个成员。Caspase-6 也称 Mch-2，其前体蛋白被 granzyme B 剪切后形成活化的 caspase-6 二聚体，可诱导细胞凋亡。Caspase-6 可剪切凋亡的关键调节蛋白 PARP，剪切核膜上关键蛋白 Lamin A，其对于 Lamin A 的识别位点是 VEID。Caspase-6 特异水解多肽底物 VEID-pNA (Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide)，释放的游离**苯胺pNA 在 405 nm 有最大吸光度。采用可见光光度比色法测定 pNA 而得到 Caspase 活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞 Caspase-6 活性。

所需仪器：

可见光分光光度计配 100μl 比色杯，或酶标仪。最佳波长 405 nm，也可测 OD400~450 nm 但灵敏度略降。

Caspase-6活性测定试剂盒 100T操作步骤：

一、组织细胞准备：

Caspase活性测定值低，最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测最佳的观察点。通常2×107细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初次测定时，单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×106细胞或2个孔的6孔板细胞。最少，单个测定反应需加20μg蛋白对应于2×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。

1、（1）细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解，冰浴10分钟，再次震荡。

(2) 组织裂解：3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。

2、4 ºC 12,000g 10分钟，取上清测定，或-70 ºC保存。

3、蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml，相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。

二、测定pNA标准曲线：

1. 用反应缓冲液稀释 10mM pNA 标准品为 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。设置不加 pNA 的零管。

2. 每一浓度取 100 μl 加入 96 孔板或 100μl 比色杯，测定 405nm 吸光度 OD 值。

3. 每一浓度标准管 OD405 值为 x 轴，对应的 pNA 浓度为 y 轴，用 Excel 制作 pNA 浓度对 OD405 值的标准曲线。

三、样品测定操作：

1. 按下表设置96孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。

2. 盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。

3. 样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计

算其含量，并以蛋白浓度校正之。

4. 测得的Caspase酶活性表示方法有两种。

(1) Caspase活性增加的百分比：100% ×实验处理组OD / 实验对照组OD，简单而可靠。(2)样品Caspase酶活力单位/mg protein，精确但计算较复杂，参见说明。

反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)

无样品空白对照高酶活性样品低酶活性样品

反应缓冲液μl 95 85 60

待测样品μl － 10 35

底物 μl 5 5 5

总体积μl 100 100 100

产品说明：

1. Caspase酶活力单位定义：参考Ch