斑马鱼定点突变构建

技术原理：DSB++DNA实现30bp内点突变改造。

应用案例：

A，构建Ndr2-linker-dendra2-V5  k1斑马鱼品系的策略示意图概述；

B，采用双缺口法在Ndr2基因上精确整合linker-dendra2-V5的可遗传率。效率提高效果需要所有四个同源重组因子。

C，用DSB方法在Ndr2基因上精确整合linker--dendra2的可遗传率。

D，Ndr2-linker-Dendra2-V5  K1阳性F2胚胎中的Dendra2荧光表达模式。比例尺，100um.

E，构建GFAP-5.5kb  K1斑马鱼的策略示意图概述。

F,GFAP基因5.5kb精确整合的k可遗传率。

流程图;

1天：确定目的基因--生物信息学分析--从功能域确定靶向切割区域--sgRNA和donor的设计。

7天：sgRNA-F引物和donor构建

3天：体外转录Cas9Capped  mRNA和sgRNA--sgRNA体外切割验证活性。

3天：显微注射--取24  hpf胚胎2管（10枚/管）进行阳性鉴定。

2天：F₀代鱼尾质检--40天取两个样(每管5个鱼尾)进行鱼尾阳性鉴定。

14天：可遗传F0代获得--与野生型杂交鉴定子代鱼苗（获得2-3尾可遗传亲本进行传代）

4天：F₁代获得--40天时进行剪尾鉴定，取两尾阳性进行单克隆测序确定最终基因型。

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