C.B.S. SCIENTIFIC 公司三类用于突变检测的电泳系统


经过25年的发展，公司研发出多种凝胶电泳技术用于快速且经济的检测DNA片段的单碱基突变。C.B.S.公司开发出三类不同的仪器用于检测突变，适用于DGGE，CDGE， TTGE， SSCP等分析。


应用：

● 检测DNA 单个碱基改变或突变

● 检测双链DNA 中的多态性

● 测定DNA 片段的熔解点

● 检测单链构象多态性


参考下表从中选择一类适合您需要的仪器。
更多参数及产品请参见上海思伯明仪器设备有限公司网站, www.springsci.com.cn.



Cat. #


DGGE


TTGE


SSCP


CDCE




DGGEK-1001

DGGEK-2001

DGGEK-2401

DGGEK-4001

DGGEK-4801


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TTGEK-2001

TTGEK-2401


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DTSK-2001

DTSK-2401


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Cipher Genetic Analysis Systems ™（Cat. #’s DTSK-2001 & DTSK-2401）


为了能用于SSCP 技术，Cipher™系统的阳极室配有一个大直径的冷却旋管，冷却旋管连接外部冷却水浴（冷却器）。C.B.S. SCIENTIFIC 公司开发出两款不同型号的Cipher™系统，DTSK-2001 型有2个凝胶系统包括两个胶盒（上图）。DTSK-2401 型有4 个凝胶系统包括2 个

双面胶盒。Cipher™ 这类电泳系统：能自动混合缓冲液和自动调解整体温度；能保持缓冲液的温度在设定值的0.2℃范围内，确保凝胶所在环境的稳定。CipherGeneticAnalysis Systems ™是唯一一类能做DGGE， CDGE， TTGE 和SSCP 四种分析的仪器。


全套突变检测系统部件：

● 电源（EPS-300-II Power Supply， 300V or 220V， 500mA， 90W）

● 胶盒（Gel cassettes）

● 带盖缓冲液灌（Tank with safety interlock lid）

● 蠕动泵（Mini-peristaltic pump）

● 梯度仪（Gradient maker）

● 梳子（ Combs）

● 垫片（Spacers）

● 玻璃板（Glass plates）

● 凝胶密封条（Gel Wrap™ gaskets）

● 白色弹簧夹（White spring clamps）

● 缓冲液虹吸泵（Buffer siphon pump）


TTGE Electrophoresis Systems(Cat.#’s TTGE-2001 & TTGE-2401)


C.B.S. SCIENTIFIC 公司开发出两款不同型号的TTGE。TTGE -2001型有2个凝胶系统包括两个胶盒。TTGE -2401型有4个凝胶系统包括2个双面胶盒。系统特点：可程序控温，搅拌器可由TTGE或DGGE自带程序控制，使用Gel Wrap™可更简便的做出垂直凝胶，单面或双面胶盒的设计可免除使用凝胶进行密封，内置蠕动泵使缓冲液循环，聚丙烯弹簧夹和带电子锁的安全罩可保护研究人员安全同时保持温度和减少蒸发。


DGGE Electrophoresis System

（Cat. #’s DGGEK-1001，DGGEK-2001，DGGEK-2401，DGGEK-4001&DGGEK-4801）


C.B.S. SCIENTIFIC 公司开发了5款不同型号的DGGE系统。DGGEK-1001是一个较小的，有2个凝胶系统，包括1个双面胶盒。DGGEK-2001有2个单面胶盒。DGGEK-2401具有与DGGEK-2001相同的缓冲液容积，但是包括2个双面胶盒，能同时跑4块胶。DGGEK-4001具有一个较大的缓冲液容器和4个单面胶盒，或4个双面胶盒8个电泳空间。


DGGE/CDGE/TTGE/SSCP四种检测技术简介


变性梯度凝胶电泳（Denaturing gel gradient electrophoresis ，DGGE）主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利变性梯度凝胶进行分离。恒定变性凝胶电泳（Constant deratarared gel electrophoresis ， CDGE）、 时间温度梯度凝胶电泳（Temporal temperature gradient gel electrophoresis ，TTGE）和温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis ，TGGE）是由DGGE经改进而成，它们在突变分析上都有着重要的作用。DGGE，CGGE及TTGE三种方法是基于相同的原理而设计的突变检测方法，均是根据DNA的解链特性而设计。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。对于同一序列组成的DNA片段来说，它具有恒定的解链温度（Tm），其序列发生改变时，Tm值亦发生改变，在含有变性因素（变性剂， 高温）的凝胶上进行电泳，当链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会改变，这就是DGGE，CDGE及TGGE鉴定突变的技术基础。


1． 变性梯度凝胶电泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）

DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。DGGE与PCR技术相结合，能非常快速的对大量标本进行分析。作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的 突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的电泳装置，而且合成带GC夹 的引物也比较昂贵。


2． 恒定变性凝胶电泳（Constant deratarared gel electrophoresis CDGE）CDGE与DGGE的区别在于CDGE聚丙烯酰胺中加入变性剂，且浓度恒定，而不是线性递增。为了提高DGGE和CDGE的检测敏感性，可以人为地加入一个高熔点区――GC夹（GC clamp）。GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而 便于分析，使DGGE和CDGE的突变检出率可提高到接近于100%。


3． 时间温度梯度凝胶电泳（Temporal temperature gradient gel electrophoresis ，TTGE）

与DGGE变性梯度凝胶电泳系统相比，TTGE不使用化学变性剂梯度，操作更简单、快速并便于重复。DNA上样于含尿素的聚丙烯酰胺凝胶。电泳过程中逐步、均一地升高温度，从而在电泳运行过程中的不同时间产生一个线性的温度梯度，变性环境由凝胶中均一的尿素浓度加上时间温度梯度形成。TTGE 时间温度梯度凝胶电泳技术加入了尿素和甲酰胺梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域（melting domain， MD）和解链行为（melting behavior） 。一个几百个碱基对的 DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链，当温度再升高依次达到各其他解链区域。


4． 单链构象多态性 （Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析SSCP技术与DGGE、CDGE 和TTGE技术基于不同的原理，SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的。

单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PGE），可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法被称为单链构象多态性 （Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析。

SSCP技术一般配合PCR技术使用，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。PCR-SSCP技术的基本过程是：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。


以上四种技术主要用途一是分析微生物群落结构组成，二是分析致病基因突变。

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