转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。

影响转染效率因素众多、细胞本身质量、各类细胞特性（这点我们优势很大，常年统计难养细胞问题）、转染试剂选择类型、质粒质量、转染方法、等。本品开发目的就是针对较难转染细胞开发，免疫类细胞、原代细胞、或对转染后荧光，病毒等表达时间要求较长或病毒滴度要求高及上清收获的方案开发，前期预实验建议从293类好转染细胞预实验后，在开始目的难转细胞。先对试剂特性有所了解后。在做293类细胞，本品可六天长时间荧光表达或病毒作用及上清收获蛋白。（辅助有促贴壁试剂，与转染前细胞状态调整，消化要求等建议参考，注明实验室用户，可发细胞图片，我们免费评价参考，深入沟通的用户，可注明细胞来源，试剂厂家，某些习惯操作手法也是大家谈论同一细胞形态差别大我司统计认为观点，我们给您建议与参考，我司有对各类难养细胞常年统计细节的习惯。质粒提取盒子，我们有推荐，越贵越好）

筛选稳定表达株，要预留足够的时间让抗性基因表达后再添加筛选压力。

可讨论

细胞培养注意事项

转染过程中血清用量

质粒提取用小牌子的，后续污染去除。

启动子：诱导型\组成型,质粒的大小和质量,免疫类细胞、原代类细胞、娇贵的细胞，体内DNA疫苗推荐 Qiagen的Endofree系列，不建议用那些快速提取去内毒素的盒子，除非很熟练。

转染RNA：RNA容易降解和防止RNAse污染，采用优质无RNAse污染的血清至关重要。转染复合物和细胞共同孵育的时间越长需求的可考虑我们促贴壁方案。

对照组参比：对于检查问题是非常有用

转染效率低参考：

转染试剂不适合

转染试剂和核酸或者蛋白的量不够，或者比例不对

基因表达时间有问题：转染后毒性大小问题，扩大或缩小孵育时间

副作用目的基因的毒性

核酸或者蛋白质量问题

报告基因或者检测系统的问题

细胞死亡率高：

过量的转染试剂或者转染复合物

细胞问题

目的基因毒性

转染效率重复性差：

细胞汇合度不同

支原体污染

细胞传代次数

全部进口试剂耗材，国产试剂耗材的暂不在讨论范围内

耐药株筛选方法以开始预实验阶段，欢迎与各位老师讨论。核心是我司促贴壁与噬斑实验（单克隆株筛选）结合使用，筛选过程方便简单。筛选后的冻存复苏，促贴壁试剂起到关键作用。

案例细胞：293FT

这个细胞好养，养好和不容易

这个首先是THERMO慢病毒腺病毒生产细胞

特点：易成团，上述胰酶方法解决

对碳酸氢钠浓度及培养箱中 CO2 浓度要求高，

一般实验室的293，HELA都是个头小，都是平时习惯造成的。吹打过重，国内库或ATCC来源个头都很大。一般实验室引进后，不好的试剂与不良操作手法，开始培养会出现黑点情况，这也是不良习惯引起细胞变小开始源头。

细胞个头大，状态好。接触质粒与转染试剂面积也大，所以转染效果要好。

细胞个头要小，反正依然

按我上述，复苏细胞应该没有死的，第二天就会长满。

个头要变小了或有黑点，就是吹打造成的，(这里给国内库培养做个说明，国内库培养这类好养细胞，也是保钟级别的试剂与耗材，新购细胞往往会出现这类问题，上述可解决这类问题，前提是试剂耗材都得标准统计）

相关参考

细胞转染前状态调整参考：

胰酶：

胰酶统计了六年，推出我们的Optimized Trypsin（下面有产品链接），对胰酶挑剔的细胞有易成团的神经胶质类、肝类、乳腺癌类、胰岛胰腺类、免疫悬浮（这个成团也可通过离心后，加入低浓度胰酶解决团聚）团聚问题

不解决，冻存后的细胞团DMSO深入不充分，容易有冰晶形成损伤细胞，导致复苏后状态不理想，成团成片细胞培养过程中中间细胞得不到完全培养基营养吸收。通过反复多家实验室验证，这点可用我们推荐胰酶，常温消化，完全利用化学作用，无机械力消化成单个细胞，按我们方法与0.25浓度胰酶消化后，吹打散细胞方法冻存后复苏比较细胞成活率，这个成活率高低，也是转染率高低理由。

https://www.biomart.cn/infosupply/79438956.htm Optimized Trypsin

促贴壁试剂：

转染过程中，对容易漂的细胞一个很好的解决方案

免疫荧光中应用，细胞更舒展，细胞器件清晰可见。

特别是感染细胞生产病毒过程中，细胞与病毒作用时间长，病毒滴度高等优点，

平时培养过程中使用，细胞着床快，明显优于不使用促贴壁培养方法，按理细胞目前有上百代生产应用，链接里有相关案例介绍，与救助珍贵细胞。

耐药株筛选问题：加药后，细胞容易受损伤，易漂，就算做成耐药株后，冻存复苏后容易丢失（活率低，细胞不着床导致）

https://www.biomart.cn/infosupply/49129998.htm 增强型贴壁试剂试验说明书链接

我们建议胰酶工作方法，用上细胞就会有改善。

加促贴壁后，促进细胞着床，生长状态好，质量好。

关于细胞质量，我们用营养极限法验证，不同来源同名细胞，1%FBS,最长时间培养，生存时间最长的，我们判定是质量最好，这个浓度血清方案，在感染病毒中建议用下，感染及转染细胞密度推荐细胞密度较满时候做。

Optimized Trypsin消化时间：3-5分钟（去完全培养基干净）促贴壁试剂加后，20-25分钟。这个参数也是促贴壁力度参考值。

以上案例应用不只是293FT这只细胞，后面列出难养类细胞应用简单说明。

延展应用可讨论：

电转仪转染细胞中，我们转染试剂可做电转液，理论上验证可行，有准备上手的老师可来信讨论。

国内库难养细胞系：beas-2b HK-2 INS-1 THLE-3这里不做说明，可来信沟通细节

单克隆筛选细胞流感病毒噬斑实验套装（各类单细胞筛选应用与技术沟通后推荐）https://www.biomart.cn/infosupply/89408280.htm

20210630 工程用大体积培养转染及免疫细胞转染，效果完全覆盖PEI转染效果（PEI起始转染细胞量较少，是与我们转染产品较大差别，转染方法可讨论），原代鸡胚、食管正常细胞转染效果优于同类任意厂家（转染前后细胞培养可深入讨论），有做核酸免疫动物用户，原代转染验证我们可发试用，转染前后细胞调整都可讨论。为提高沟通效率，建议发我们可分享部分的POTOCOL及遇到的问题描述，-以上沟通限定进口试剂耗材。正规细胞库老师要有时间测试，我们全程免费测试，无数量限制，

20210730案例：正常组织食管细胞系，无血清方案培养（培养特点无血清容错率差）对转染试剂毒性要求高，我们案例转染后死细胞10%转染效率5% （转染条件未经优化，常规转染）

20210910：正常组织细胞系HUVEC-武汉库来源，转染RNA 国产试剂培养体系，初次常规转染5% （判断其他厂家应该没有转染效果，）经优化RNA梯度后，转染效率40% 细胞漂的多（也可以说是死细胞）

技术意见：转染效率太高，建议用户重购新细胞，进口培养体系培养后，在优化条件转染，后续结果在公布

该产品设计也是按较高水准，近期这几个案例，也是我们在产品设计时结合原代与难转染免疫类细胞常见问题常年统计与解决过程中结合，转染常见问题全盘考虑的一个结果认定，去年初我们与几个重点室讨论的目前国内原代建系很容易，当时思路还不成熟不全面，与老师沟通也是某一个点的讨论，通过近期原代，转染，单克隆等相关问题解决与统计，目前原代建系容易，是我们已往常年问题统计与解决问题的整个思路汇总，一个小小的成绩体现。还希望后面得到各实验室技术经验指导提携。共享经验，也是后面碰到问题少走弯路一个不错的办法，提升试剂质量为目的。

原代建系参考：国内库有很多株自己建的细胞系，准备做原代建系，选择这类细胞在建系，摸些条件手法等，相对容易些，是个不错的预实验选择，这类细胞一般十几代都没问题，在这十几代中，在继续建系，相对容易，最近统计了几例，这类细胞与传统成熟细胞系培养有些差别，传统培养经验还要结合原代特性，密度抑制，通过消化传代，何时传代合适，等条件摸索出原代适合的条件。消化，冻存等枝节处，都用较稳妥可行的经验方法，在平时培养过程中要总结优出更可行的方法与经验，容错率要高，消化冻存在优化这两项我们已经开始统计了，有兴趣老师可一起讨论。

20211101：我司是该试剂研发生产单位，新方法技术突破针对免疫类，原代类转染提高效率，有兴趣老师可来信沟通，也欢迎与生物类产品生产有GMP资质北京附近公司洽谈合作，目前应用案例有中试生产相关蛋白用户（在冻干保护剂遇到瓶颈，也欢迎与国内冻干保护剂研发生产相关相关合作提携-相关研究技术老师欢迎加盟-国外这个技术相当成熟-我们上游工艺已经有不错的成绩）

20220818

细工转染试剂开发介绍

脂质体转染细胞系类较经典的试剂：

细胞系应用广泛，技术成熟。

就目前用户原代与无血清培养的细胞更娇贵，细胞质量缓冲能力差，细胞容错性差。超量培养用户需求扩大。

脂质体类应用

减毒性是细工开发相关产品的目的（与市场上大部分PEI类转染原理不同）

用户试用初期在几个难转细胞中表现还不错。因数据还不多，用户技术水平不一，所用试剂等级不一等，品牌观念等因素。

库存有五百只1ml特价销售。

细工在开发相关产品理念原料的质量严选，质高。

在普通细胞转染上应该表现突出。

欢迎老师试用采购。

下批生产会添加几个要点。

无血清细胞容错率低（常规培养中容易团聚问题解决，超量培养）

大质粒转染-50Kb以下

悬浮免疫类转染（细工提供参考POTOCOL）

量大试用理想有预付用户，我们提供凯杰提取的验证质粒5-6KB

上述难点要点有讨论的用户，建议用保种级别试剂讨论与问题解决意义积极。

学习中，ATCC定制转染试剂，不知效果如何。

难点问题异常珍贵。

（国外公司推出的几类新品都直指难点要害，问题统计重要）

新手练习细胞建系非常合适。

价格，实验要求，技术经验储备，厂家细心的详细售后服务（细节决定成败）。

筛稳转株，是我们优势，毒性低，价格合理，适合大量转染实验室，

梯度优化很重要。

转染前细胞优化技术储备足，

那些难养的，难转的，优化步骤都可讨论

要点参考简述

liver：解决团聚，正常增殖传代

breast：正常增殖传代

Pancreatic islet：胰酶消化优化

Glia cerebri：成片，锚着

Original generation:离体后处理时间，快

Serum free:缓冲弱

blood：稳妥可行培养方案，增殖较快方案建议验证细胞质量平稳性。

细工优势验证：二倍体类解决（也是上述都属于难养类）培养顺利，有些通用难点，也有各类突出要点。

路过的脂质体高手老师，多多提携啊

20230412

增强贴壁试剂处理难转细胞方法参考

（原代免疫类、原代正常类、胶质类、）

促贴壁处理培养板PBS清洗后

1. 逆转录病毒保存液 (-80 ℃) 于37 ℃水浴融解。

2. 将病毒液加入包被后的24孔板，每孔300 μl。

3. 32 ℃放置4小时。

4. 吸出病毒保存液。

5. 每孔加入待转染的细胞悬液400 μl (通常细胞浓度为1 × 105/ml) 。

DNA，RNA转染用户，建议用量配比参考GIBCO-POTOCOL后，在优化。需POTOCOL来信告知。

试用发送中，使用要求，培养体系全部进口（最好是GIBCO体系，细胞可以正常传代成功率高）截止到2023年10月1日，实验满意尽量付款，成本太高了，申请邮箱procyte@126.com，实验照片要给我们。案例统计用（也可文章发表后再给我们也可以）试用期间用户，文章发表后，可申请我司赞助奖励，国际名流期刊的，一分一万元单独奖励。

告知细胞详情（离体后处理我们有相关总结,可讨论细节）

质粒目前推荐小于11KB，稍大质粒请注明详细要求，后面会一直统计相关难点，关键点。

无PEI成份

祝顺利

20230413

难转染，大体量转染，大质粒转染参考

难转染细胞-增强贴壁试剂辅助处理方法参考

质粒：大质粒，柔和平稳处理可行性更高

细胞：原代免疫类、原代正常类、胶质类。

讨论难点：原代首代处理（细胞质量）、团聚、成片相关细胞特性影响转染效率相关办法讨论，

例如：原代胶原酶处理贴壁不牢（上皮）成纤维胰酶处理差速贴壁筛选。EDTA消化传代处理（干细胞）

免疫类：成球，免疫保护。

二倍体细胞：顺利生长，高质量细胞状态（传代平稳前期验证）

细胞工厂大体量培养后转染优势，细胞培养增殖都有很多的相关技术储备与相关试剂开发。结合转染新方法加入，让批量转染可行性更稳妥。

20230424

慢病毒扩增建议用我们全套DMEM，胎牛，胰酶。与您现有体系做在后续实验比较。对保种试剂级别评测的一参考建议。

20230428

无毒转染试剂开发出来后，目前转染效果无，有时间的话，任意发挥下毒性低，发挥空间很大，真对大质粒，难转细胞（更新资料有进展可发您）。传统步骤文献步骤都不建议用现状就在那，对照组建议用我们优化磷酸钙（优化了十年了），真对工业户开发的。

20231111

转染试剂开发进展
细工推出质粒与转染试剂1：1方案，转染试剂毒性低一直是我司该类产品开发主线。提高转染试剂浓度，也是为成球转染，动物体内转染开发应用考虑，有兴趣用户建议留转染详细信息，细工给些参考间建议（细胞名称，生长特点及难点，成团特点，团大小，生长天数，所加辅助因子厂家货号，计量，浓度等。转染目的效果。

20231218

免疫细胞转染细工要点参考
关键点解决细胞团聚，转然前我们推荐Optimized Trypsin优势不是一般的大，解决成团是免疫细胞关键点，用这款一没理由就是对细胞无损特点，膜无损，具体介绍可看产品介绍，通过六年以上案例统计。
关键点反转法，是目前我们统计大品牌转染得效果不错后推荐，下面有相关厂家及货号，该类产品我司辅助锚着是促贴壁试剂辅助，这个产品开发应用五年了（工业病毒生产用，293类）及免疫细胞共聚焦也可以，下面有连接说明说明。
关键点提高病毒滴度，参考下面介绍增强贴壁试剂链接，提高病毒滴度很关键，目前脑胶质溶瘤相关用户可能已到中式（订货量上判断，五年应用，这部分不讨论用户案例，技术部分可以）
关键点突破理由两点相关辅助简单介绍
冻存复苏优化，DMSO方法，提高活率细胞量与质量，目前临床合作实验室PBMC活率80%保守介绍，目标能到尽量在高些，需验证建议用贴壁试剂案例293验证比较稳妥，很多细节要沟通，能做到我们产不多参数，应用免疫细胞应该容易很多。
试剂耗材我们指定，进口耗材，及细工试剂。
巨噬培养生长分化控制，膜提取，转染方面配套该细胞目前只在理论阶段，实施还要很长时间。有涉及转染部分，在沟通讨论。
免疫类原代培养、建系、类器官等，有相关研究可来信注明，更多资料发您，邮件联系。