分子水平实验-分子生物学服务 -技术服务-生物在线

分子水平实验

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产品名称：分子水平实验

英文名称：分子水平实验

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更新时间： 2023-09-21T16:18:31

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广州竞远生物科技有限公司

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产品详情

核酸提取

服务简介

高质量DNA和RNA是基因获取的前提条件，依托高品质的各种 DNA/RNA提取试剂盒，涵盖了动植物组织、血液、细菌、真菌及包括石蜡、淤泥、水样等特殊样品，可以为客户提供高质量的DNA/RNA样品，满足客户普通PCR、QPCR、文库构建、基因调取、分子标记、基因杂交等各种科研需求。

主要流程
1.样本裂解提取
2.纯化电泳检测
3.实验结果图片扫描

客户提供
提供样品
菌样:饱和浓度样品不少于1ml，其它菌样不少10⁶个菌;
土壤淤泥样:不少于100g样品;
血液样:全血不少于300ul;
动物组织:不少于200mg;
植物根茎叶等组织:不少于500mg

最终交付
交付成品

DNA或RNA样品
交付报告

提取的质量报告(包括电泳图、浓度、质量检测等数据)。

荧光定量PCR技术服务

服务简介

实时荧光定量PCR技术(Real- ime Quantitative PCR，qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团(包括荧光染料或荧光标记的特异性探针），对PCR产物进行标记跟踪，随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样即可通过荧光信号强度的变化实时监测整个PCR过程中产物量的变化，并结合相应软件对产物进行分析，可以得到荧光扩増曲线，从而计算待测样品中目的基因初始模版的量，常用于分析目的基因的表达水平的变化。广州竞远生物科技有限公司，可根据实验目的，设计实验方案(相对定量或绝对定量; SYBR Green I或 Taqman探针方法)，用完全按照符合国际标准(MIQE)的荧光定量PCR(qPCR)试剂完成实验，提供符合文章发表的客观事实实验报告和原始数据

SYBR Green荧光染料法:适用于任何DNA，无需设计探针，采取双标准曲线法，实验周期短，结果重复性好，灵敏度高。

Taqman光探针法:经验丰富的实验技术人员设计探针，对目标基因有高特异性，实验重复性好，相对于 SYBR Green?法，灵敏度更高。

荧光定量PCR服务流程

1、根据基因序列设计特异性的引物或荧光探针
2、提取样品DNA/RNA、电泳、反转录

3、 Realtime PCR(荧光定量PCR)，进行扩增曲线、溶解曲线、表达量差异分析等实验

4、实验完成后，提供完整的实验报告(含软件分析结果)及引物等实验材料

样品要求

细胞＞1×10⁶个;组织＞50mg;细菌湿重＞50mg

1请提供新鲜材料或直接提供已纯化的DNA/RNA，确保总量＞5g样品。如果目的基因表达量较低时，应尽量提供更高浓度的总RNA或DNA

2.请提供已知的全长基因序列( Genebank Accession Number、 Gene ID)

3请提供尽可能详细的背景资料:生物物种信息( Human Mouse、Rat等)、DNA/RNA来源、丰度等

4.客户可以提供引物，没有引物的情况下，本公司帮助设计合成。

荧光定量PCR(qPCR)报告内容

总RNA(或DNA)浓度，电泳图片，扩増曲线，熔解曲线，Ct值以及数据统计分析。

病毒包装

1.慢病毒包装

服务简介

慢病毒( Lentiviruses)属于逆转录病毒科。慢病毒( Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、 MICRORNA研究以及活体动物实验中。我公司提供慢病毒载体构建、RNAi( SHRNA)、 MIRNA、过表达和干抗慢病毒包装以及基于慢病毒技术的稳定细胞系构建服务。灵敏度更高。

整体实验流程

1.构建质粒

a.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩増引物，同时引入酶切位点，采用PCR技术(采用高保真KOD酶，3K内突变率为09％)从模板中(cDNA质粒或者文库)调取目的基因CDS区( coding sequence)连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。

b.慢病毒干扰质粒载体的构建合成 SIRNA对应的DNA须环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体。

c. MIRNA载体构建从 genomic中调取基因相应的Mir前体，并在调取引物中引入酶切位点。2.共转293T细胞
3.收集病毒
4.病毒转化、浓缩

5.病毒感染活性鉴定

6.成果交付

质量控制

我们会对每一批病毒都进行滴度检测，严格控制质量，让你百分百放心。针对用携带荧光报告基因的转移质粒生产的病毒，我们会先用荧光法检测病毒的转导率，如能达到使用要求，再进一步采用qPCR法检测病毒滴度。

2.腺病毒包装

实验原理

腺病毒( Adenovirus)是一种没有包膜的直径为70-90nm的病毒颗粒，为线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列

腺病毒为5型血清型腺病毒，缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1区和E3区。E1是腺病毒复制所必须的，E1的缺失使其不能自身复制，只能依靠包装细胞如HEK293细胞提供的反式互补进行复制扩增，以此保证腺病毒的安全性。E3基因表达的蛋白能对抗宿主的抗病毒防御系统，E3区的去除能减少宿主的体内免疫反应。

腺病毒包装采用的是最新的 Admax:系统，通过Cre-loxp重组酶，使共转染到HEK293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒(腺病毒基因组质粒)在重组酶的作用下产生重组腺病毒，获得的病毒滴度更高，其病毒滴度可以达到1×10^12 pfu/ml

腺病毒载体有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、等多种启动子可供选择;而且还有EGFP、 ZSGRE、Tomato、 mcherry、EYF等多种荧光标记蛋白可供选择。

3.腺病毒相关病毒包装

实验原理

腺相关病毒( adeno- associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。

腺相关病毒血清型种类齐全，可提供AAV1、AAV2、AAV3、AV4、AV5、AV6、AAV7、AV8、AAV9、AAV-D共10种血清型，而且还可以包装双链AV( SCAAV)。

巴菲尔生物的腺相关病毒载体有CMV、mC.MV、CAG、PGK、RK1、FF1a、GFAP等多种启动子可供选择;而且还有EGFP、 Zsgreen、 tdtomato、 mcherry、EYFP2等多种荧光标记蛋白可供选择;同时可以提供诱导型AAV病毒的包装，如Tet-On系统等。

双荧光素酶报告基因检测

实验原理

通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶( firefly luciferase)的表达载体，如pGL3，构建成报告基因质粒，使这段DNA序列调控 luciferase的转录。然后将报告基因质粒转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，并加入底物荧光素后(luciferin)， luciferase可以催化荧光素发出荧光，从而可以通过测量荧光值的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率的差异带来的误差，可以同时转入 Renilla?芡光酶素的报告基因质粒作为内参，即双荧光报告系统。该实验可以用于研究转录因子对promoter或 enhancer序列的调控，也可以用于研究受体活性，细胞内信号通路，或者 MICRORNA对基因表达的调控。

应用

1.澘在启动子/启动子核心区域检测
2.澘在增强子/抑制子等调控子核心元件检测

3.启动子区可能的转录因子结合位点检测

4.启动子/增强子与转录因子的相互作用;

5.病毒/细胞相互作用;

6.药物等化学诱导因素对启动子活性的调节(抑制或增强);

7.射线等物理诱导因素对启动子活性的调节(抑制或増强)

8. MICRORNA靶基因验证。

染色质免疫共沉淀相关服务

实验原理

染色质免疫共沉淀( Chromatin Immunoprecipitation，ChIP技术主要是用于研究DNA和蛋白质的相互作用。染色质主要是由组蛋白和缠绕在上面的DNA组成。在染色质上还结合了许多转录因子、染色质重塑相关蛋白和非编码RNA。染色质上结合的蛋白或者组蛋白上不同的共价修饰可以通过改变染色质的结构，或者招募相关的因子来调控基因的表达。通过ChIP技术，我们可以研究不同的组蛋白修饰、转录因子以及染色质上结合的一些其他蛋白，在基因组上的分布。
ChIP实验的主要原理是，当DNA和蛋白结合或者距离很近时，通过甲醛固定交联，在DNA和蛋白分子之间形成共价键。将染色质通过超声波破碎或者徴球菌核酸酶处理，打断成小片段，然后通过特异性的ChIP级别抗体，富集目的蛋白。经过逆交联处理之后，消化水解目的蛋白，回收得到目的DNA，从而得到与目的蛋白相互作用的DNA信息。

整体实验流程

1.细胞交联

2.抗体有效性检测

3.免疫共沉淀

4.建库测序/PCR验证

样本要求

动物细胞:3x10⁷～5x10⁷，1％的甲醛交联，干冰运输。

动物组织:0.5-2g，对于较大的组织，先切成1-5mm的组织块，干冰运输。
植物组织:5-20g，干冰运输。

抗体需要提前验证满足ChIP或者IP实验要求。

生物信息分析内容

标准信息分析

1.去接头污染，去低质量 reads和测序质量评估

2.ChIP测序序列与参考基因组序列的比对

3.ChIP测序唯- reads在全基因组的分布

4.Peak鉴定及基因原件分析

5.Peak相关基因筛选与GO功能聚类分析、 Pathway分析

高级信息分析

可根据客户的需求，定制高级信息分析内容

交付结果

1.测序原始数据。

2.实验结果类文件。

3.分析析报告以及分析结果文件。

4.部分发表文章用的方法描述性书写(定制性)。

甲基化检测服务

实验原理

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶( DNMTS)的作用下使CpG二核苷酸5～端的胞喀啶转变为5”-甲基胞喀啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。

注:M:甲基化引物PCR扩増;U:非甲基化引物PCR扩増。SW1353细胞在药物处理后从完全甲基化转变为完全非甲基化，OUMS-27细胞在5-Aza-dC处理后从部分甲基化部分非甲基化状态转变为完全非甲基化。

Northern或 Southern Blot检测服务

实验原理

Southern杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法，由 Southern于1975年创建，称为 Southerne印迹技术。其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

Northerne印迹杂交( Northern blot)是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法，主要利用碱基配对原则，利用特性的DNA探针与其杂交，经过显影技术分析RNA的最和大小。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为 Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot

实验流程

a) Northern Blot

1.完整mRNA的分离

2.根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离

3.将RNA转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA在凝胶中的相对分布

4.将RNA固定到支持物上

5.固相RNA与探针分子杂交

6.除去非特异结合到固相支持物上的探针分子

7.对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析

b）Southern Blot

1、制备待测DNA2、DNA限制酶消化

3、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品
4、电泳凝胶预处理
5、转膜
6、探针标记
7、预杂交

8、 Southern杂交

9、洗膜

10、放射性自显影检测
11、实验结果分析及报告

样本要求
1.新鲜组织:

用解剖刀等迅速切成小碎块约30-100mg，放入20mL离心营中开盖液氮速东15min.80度保存，干冰运输。每个northern blot泳道提供2-3管样品。注:解剖刀处理组织的时间尽量控制在1min以内。液氮速冻时必须开盖以防炸裂。

2细胞样品:

县浮细胞1000-1500rpm，5min，常温离心收集细胞。贴壁细胞用胰蛋白酶消化后吹丁收集，PBS洗涤细胞，去除多余培养基和胰蛋白酶。开盖液氮速冻15min，-80度保存干冰运输，一般情况下，细胞培养的6孔板每孔细胞数量约为0.5-2*106个。每个离心管中的细胞数量控制在5*10⁶个左右1每个泳道提供2-3管样品。

3.RNA样品:

RNA溶液(DEPC- treated water溶解):-80度保存，干冰运输。

RNA沉淀:保存在75％乙醇(无核酶)中的RNA沉淀.2～8度保存1周，20度保存一年;加冰块低温运输。质量检测:取1-2L的RNA进行球脂糖凝胶电泳，5s，18s，28清晰可见，28的亮度应为18的1.5～2倍;无基因给污染，纯度、浓度检测:0D260/280=1.9-2.2。浓度300 ng/ul.

4.DNA样品(双蒸水溶解)

2-8度短期保存，-20度长期保存;加冰块低温运输。质星检测:取1-2ul的DNA进行琼脂糖凝胶电泳无蛋白质和RNA等物质污染无降解弥散，条带清晰。

纯度、浓度检测:OD260/280=1.8～2.0，浓度＞100ng/uL.

5.注意事项:

请严格按照样品提供原则准备样品.由于未按照要求提供样品.而造成的实验结果不理想我公司不承担相应责任，请知悉。我们不接受有致病性的样品，请知悉。