LightScanner HRM-高分辨熔解曲线突变检测法

 高分辨熔解(high-resolution melt, HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的post-PCR技术，不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品基因型的分析。这种方法因其操作简便、快速，结果准确，并且实现了真正的闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。

高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的SNP检测手段：

Ø    仪器设备—LightScanner Instrument 96；专利的荧光染料技术，专利的高分辨PCR产物溶解曲线基因突变检测（Utah University）技术；LightScanner Call IT软件和专门用于HRM引物设计软件

Ø    快速、高通量—LightScanner 5分钟完成96/384孔板的PCR产物检测， 20000个SNP/天

Ø    准确、灵敏度高、特异性好—LightScanner 100%准确性、特异性（<400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（400~1kb）；肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变

Ø    重复性好—LightScanner重复性100%

Ø    操作简便—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型

Ø    只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，无污染，PCR产物可以进行下游分析

原理：

       HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，从而对样品进行检测。随着高精度PCR仪（Rotor-Gene 6000和Lightscanner）和饱和染料（LC Green,Eva green）的出现为HRM这一技术的普及使用成为可能。由于HRM完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。

实验流程：

 在PCR反应前将LC Green荧光染料与反应Buffer、引物、模版DNA混合，LC Green染料饱和加入（LC Green荧光染料对PCR不会有任何抑制作用），然后将PCR产物（96孔板或者384孔板）直接放入LightScanner或HR-1仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯和突变，软件自动分型。 LightScanner为高通量、高分辨率、高灵敏度检测手段，通过上述检测分型之后，只有约1%的PCR产物需要测序，因此极大的降低了测序的工作量。 

样品要求：

      PCR产物浓度均一，无非特异性扩增，检测片段范围50bp~1000bp。