质粒大量提取试剂盒北京索莱宝科技有限公司

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性能参数

产品名称: 质粒大量提取试剂盒
英文名称: 质粒大量提取试剂盒
产品货号: D1110
产品规格: 常温保存,复检期一年。
产品产地: solarbio
产品商标: solarbio
价    格: 300元
保存与运输: 10T
现货状态: 充足
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/12/18 14:58:00
浏览人数:2852
诚信指数:1359点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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北京索莱宝科技有限公司
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产品详细描述

质粒大量提取试剂盒

 

产品说明: 

        本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的 DNA 的原理特异性提取质粒 DNA。  离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附 DNA,可*大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物,一般从 50-100ml 大肠杆菌 LB 培养液中,可快速提取 200-300μg 高纯度高拷贝的质粒DNA,提取率达 85-90%。  使用本试剂盒提取的质粒 DNA 可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA(将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入) ,混匀,置于 2-8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。  

操作步骤: 

1.  收集 50-100ml 过夜培养的菌液 11000rpm离心 10分钟,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 

2.  向留有菌体沉淀的离心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (请先检查是否已加入 RNaseA)  ,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。 

3.  向离心管中加入 5ml 溶液Ⅱ  ,温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。  注意:①翻转一定要温和,以免污染细菌基因组 DNA。②作用时间不要超过 5 分钟,以免质粒受到破坏。 

4.  向离心管中加入 7ml 溶液Ⅲ  ,立即温和地上下翻转 6-8 次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀(如菌液过多,可在此步放置 5 分钟,以尽可能的降解 RNA)。11000rpm 离心 10 分钟,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,注意尽量不要吸出沉淀。 

注意:溶液Ⅲ加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。  如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。  

5.  将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中),室温放置 2-3 分钟,11000rpm 离心 30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中(如为提高得率,可将收集管中的液体加入吸附柱再次吸附一次)。 

6.  向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),11000rpm 离心 2min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 

7.  向吸附柱中加入 6ml 漂洗液,11000rpm离心 2min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 

8. 11000rpm离心 5min,将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影晌后续的实验如酶切、PCR 等。 

9.  将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加1-2ml经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置5min,11000rpm离心 2min,收集质粒溶液用于后续实验。 

10.  为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置 5min, 11000rpm离心 2min。 

注意事项: 

1.  使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在 37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄后再使用。溶液Ⅱ  、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即拧紧盖子。 

2.  洗脱缓冲液体积不应少于 500ul,体积过小影响回收效率;洗脱液的 pH值对洗脱效率也有影晌,若需要用水做洗脱液应保证其 pH值在 8.0 左右(可用 NaOH 将水的 pH 值调至此范围), pH值低于 7. 0 会降低洗脱效率。 DNA产物应保存在-20℃,以防 DNA 降解。 

3.  如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒,应加大菌体使用量,使用 400-800ml 过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ  、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。 

4. DNA浓度及纯度检测:得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。  得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为 1 相当于大约 50μg/ml双链DNA、 40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为 1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响吸光值,但并不表示纯度低。  

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 相关文献:

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《Enhanced freeze tolerance of baker’s yeast by overexpressed trehalose-6-phosphate synthase gene (TPS1) and deleted trehalase genes in frozen dough》 作者:Haigang Tan,Jian Dong,Guanglu Wang,Haiyan Xu,Cuiying Zhang,Dongguang Xiao 期刊:Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 影响因子:2.533 PMID:24951963
《A two-step integration method for seamless gene deletion in baker’s yeast》 作者:Jian Dong,Guanglu Wang,Cuiying Zhang,Haigang Tan,Xi Sun,Mingyue Wu,Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影响因子:2.275 PMID:23597844
 

北京索莱宝科技有限公司目前备有现货1500种,当天即可发货,可以满足大部分高等院校以及高级研究所的实验要求,同时省去您焦急等待的时间。欢迎前来咨询。

 

 

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