如意连TM试剂盒B-克隆与表达-试剂-生物在线
如意连TM试剂盒B

如意连TM试剂盒B

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产品名称: 如意连TM试剂盒B

英文名称:

产品编号: 1902-010

产品价格: 0

产品产地: 上海

品牌商标: 斯丹赛

更新时间: null

使用范围: null

上海斯丹赛生物技术有限公司
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 一、产品描述

如意连TM试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品。该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至目的表达载体上,省去了克隆至T载体的中间步骤,可高效克隆50 bp-5000 bp片段。只需在PCR产物两端引入特异性末端序列,并将该PCR产物和试剂盒中提供的目的载体混合,仅需室温反应10 min即可进行转化,完成定向克隆。克隆阳性率最高可达100%。插入片段的PCR产物无需进行DNA纯化即可直接用于分子克隆,省去了纯化酶切胶回收等步骤,极大的简化了实验步骤。

二、产品组分

货号

组分

产品含量/规格

1922-010

10xBuffer B

20µL/tube

1

1912-010

Enzyme Mix B

20µL/tube

1

1930-010

Control insert

10µL/tube

1

 

ddH2O

500µL/tube

1

三、保存

-20ºC保存一年。

四、实验流程

注:目的片段PCR扩增时,通过引物设计时在5’端引入特定的酶切序列,图中以蓝色片段代替

 

 

5.1.制备PCR产物

    5.1.1设计扩增引物

引物设计原则:

1)确定目的片段中不含有GAAGAC酶切位点。

2)目的片段设计引物:PCR引物包括目的片段特异引物序列和酶切位点序列(注:目的片段的引物设计遵循引物设计原则即可

   正向引物(5’-3’):GGGGgaagacggagtg +目的片段正向特异性引物序列

   反向引物(5’-3’):GCCGgaagacaatggg +目的片段反向特异性引物序列

    5.1.2 插入片段PCR扩增

目的片段PCR时注意事项:

1)酶的选择:插入片段可用任意PCR (Taq酶或高保真酶) 扩增,无需考虑产物末端有无A加尾。但推荐使用高保真聚合酶进行扩增,以减少扩增突变的引入。

2)反应条件:根据引物的退火温度及目的片段大小确定PCR反应程序。

3)建议进行PCR产物纯化。如果PCR片段是从质粒模板扩增的,且该质粒与重组载体具备相同的抗性,建议将PCR体系中的质粒模板用DpnI进行消化。

 

5.2.  如意连反应体系

Vector

1μl

Inserts

1-50ng

10x Buffer

2μl

Enzyme Mix A

1μl

ddH2O

加水至20μl

总体系

20μl

 

5.3. 连接反应

    体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀) 37℃反应10 min(亦可在室温条件下进行反应,但克隆数会减少数倍,而克隆正确率不会变化,建议尽量在37℃条件下进行反应),待反应完成后,可将反应产物直接进行转化;也可储存于-20,待需要时解冻转化。

 

5.4.  重组产物转化、涂板

1 10 μl连接反应液,加入到100 μl感受态细胞中,将溶液混匀,冰上放置30 min

242℃热激45秒,冰水浴孵育5 min

3) 加入500 μl SOC培养基,37℃摇菌30 min

4) 4000rpm离心5min,弃上清,留100 μl将沉淀打散,将菌液均匀涂布在含有卡那霉素的平板上。将平板倒置,于37℃培养12-16小时。

 

5.5.  阳性克隆鉴定

   1)测序:直接将2-3个细菌克隆,送给测序公司,使用通用引物进行测序。

   2)限制性内切酶酶切鉴定法:挑选2-3个细菌克隆接种于卡那霉素的液体培养