HisSep Ni-NTA Agarose Resin(His标签蛋白琼脂糖纯化树脂)-蛋白纯化-试剂-生物在线
HisSep Ni-NTA Agarose Resin(His标签蛋白琼脂糖纯化树脂)

HisSep Ni-NTA Agarose Resin(His标签蛋白琼脂糖纯化树脂)

商家询价

产品名称: HisSep Ni-NTA Agarose Resin(His标签蛋白琼脂糖纯化树脂)

英文名称: HisSep Ni-NTA Agarose Resin(His标签蛋白琼脂糖纯化树脂)

产品编号: 20502ES10

产品价格: 498.00

产品产地: 翌圣生物

品牌商标: Yeasen

更新时间: 2023-12-08T14:15:33

使用范围: null

规格 价格
10mL 498.0
50mL 2098.0
100 mL 5328.0
2x500 mL 42686.0
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
  • 联系人 : 李自转
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产品描述

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以交联的6%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,与Ni-IDA树脂相比,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一。

 

产品性质

基质(Matrix)

交联的6%琼脂糖凝胶

径(Bead size)

45-165 µm

载量(Capacity)

>40 mg 6×His-tagged protein/mL基质

耐压(Tolerance Pressuremax

0.1 MPa, 1 bar

储存缓冲液(Buffer)

含20%乙醇的1×PBS

 

运输和保存方法

冰袋运输。4℃保存,有效期2年。

 

注意事项

1.了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.产品仅作科研用途!

 

使用方法

(一)纯化流程

1 缓冲液的准备

缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。

附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer (pH8.0)

50 mM NaH2PO4 

300 mM NaCl

10 mM imidazole

NaOH调pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm过滤除菌

NaH2PO·2H2O    7.8 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         0.68 g

Wash Buffer (pH8.0)

50 mM NaH2PO4 

300 mM NaCl

20 mM imidazole

NaOH调pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm过滤除菌

NaH2PO·2H2O    7.8 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         1.36 g

Elution Buffer(pH8.0)

50 mM NaH2PO4 

300 mM NaCl

250 mM imidazole

NaOH调pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm过滤除菌

NaH2PO·2H2O    7.8 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         17.0 g

 

包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer (pH8.0)

8 M Urea

100 mM NaH2PO4 

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm过滤除菌

Urea             480.5 g

NaH2PO·2H2O    15.6 g

Tris·HCl              15.76 g

Wash Buffer (pH6.3)

8 M Urea

100 mM NaH2PO4 

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至6.3, 0.22 µm或0.45 µm过滤除菌

Urea             480.5 g

NaH2PO·2H2O    15.6 g

Tris·HCl              15.76 g

Elution Buffer(pH4.5)

8 M Urea

100 mM NaH2PO4 

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至4.5, 0.22 µm或0.45 µm过滤除菌

Urea             480.5 g

NaH2PO·2H2O    15.6 g

Tris·HCl              15.76 g

 

 

2 样品准备

2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)

1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。

2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入,其终浓度为1 mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。

3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1 mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加入溶菌酶。

4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。

5)收集上述澄清蛋白液,10000 rpm,4℃离心20-30 min。取上清0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。

 

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶,5000 rpm离心10 min,收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。【注】对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。

 

2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)

1)将培养液转移至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体去上清。

2)按照菌体:裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。

3)将破碎液转移至离心管,10000 rpm,4℃离心20-30 min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。

4)按照菌体:裂解液(含8 M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。

5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

 

3样品纯化

1)装柱:将HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。

2)清洗:3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。

3)平衡:至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。

4)上样:注意控制加样速度,确保目的蛋白与Ni2+充分接触,以提高纯化得率。【注】注意收集流出液,用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。 

5)平衡/洗杂:Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。注意收集流出液。【注】在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。

6)洗脱:使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱,收集洗脱液即目的蛋白溶液。

7)清洗:依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。【注】建议在清洗之前用更高浓度咪唑(如500 mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。

8)保存:5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。

 

4 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。

 

(二)在位清洗

当填料使用过程中发现反压过高(>0.5 Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-Place,CIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

 

1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸溶液,接触时间为1-2 h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

 

2 去除离子作用结合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。

 

(三)填料再生

当填料使用过程中发现反压过高,填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:

1)使用5倍柱体积去离子水清洗填料;

2)使用5倍柱体积100 mM EDTA(pH 8.0)剥落镍离子;

3)使用10倍柱体积去离子水清洗填料;

4)使用0.5 M NaOH清洗5倍柱体积,停留10-15 min;

5)使用10倍柱体积去离子水清洗填料;

6)使用3-5倍柱体积100 mM NiSO4再生挂镍;

7)去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。

 


附表3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况

试剂种类

浓度

还原剂

5 mM DTE

0.5-1 mM DTT

20 mM β-mercaptoethanol

5 mM TCEP

10 mM reduced glutathione

变性剂

8 M urea

6 M Gua-HCl

去污剂

2% TritonTM X-100(nonionic)

2% TweenTM20(nonionic)

2% NP-40(nonionic)

2% Cholate (anionic)

1% CHAPS (zwitterionic)

其他类

500 mM imidazole

20% ethanol

50% glycerol

100 mM Na2SO4

1.5 M NaCl

1 mM EDTA

60 mM citrate

缓冲液

50 mM sodium phosphate, pH7.4

100 mM Tris-HCl, pH7.4

100 mM Tris-acetate, pH7.4

100 mM HEPES, pH7.4

100 mM MOPS, pH7.4

100 mM sodium acetate, pH7.4

 

附表4 问题及解决方案

问题

可能原因

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

裂解液中可能含微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22 µm或0.45 µm)过滤,或离心去除。

样品中含高浓度的核酸,延长破碎时间直至粘度降低,或添加DNaseI (终浓度为5 µg/mL),Mg2+(终浓度1 mM),冰上孵育10-15 min

样品太黏稠

有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。

洗脱组分中无目的蛋白

蛋白可能是包涵体

可通过电泳检测裂解液,分析上清中是否有目的蛋白,包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式

表达量太低

优化表达条件,使用包涵体纯化缓冲体系

目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤中已被洗下来

提高Wash Buffer的pH值,或者降低咪唑浓度

目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来

降低Elution Buffer 的pH,或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度

使用10-100 mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到蛋白

蛋白降解

菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂

在4℃下进行纯化操作

洗脱组分不纯(含多种蛋白)

洗杂不彻底

增加Wash Buffer 体积

样品中含有其他His标签蛋白

通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段(如去离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。

填料颜色变浅或变成白色

镍离子脱落或者剥离

按照填料再生的操作重新挂镍离子

填料呈现褐色

缓冲液中含有DTT等还原剂

参考附3适当降低还原剂DTT的浓度,或改用巯基乙醇

上样过程中蛋白发生沉淀

操作温度太低

室温下进行上样

 

蛋白发生聚集

在样品和所有缓冲液中添加稳定剂,如0.1%Triton X-100或Tween-20

 

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