His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂上海翊圣生物科技有限公司

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性能参数

产品名称: His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂
英文名称: HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF
产品货号: 20503ES10
产品规格: 10ml
产品产地: Yeasen
产品商标: Yeasen
价    格: 798.00元
保存与运输: 冰袋运输。4℃保存。有效期2年。
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/11/11 17:23:00
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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产品详细描述

                        HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF

His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂

产品信息

产品名称          

产品编号

规格

储存

价格(元)

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂)

20503ES10

10ml

4

798.00

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂)

20503ES50

50ml

4

3358.00

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂)

20503ES60

100ml

4

5838.00

产品描述

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外,因其基质的耐压性(可耐受最高0.3 MPa的压力),该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化,可在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化。

产品性质

基质(Matrix

高度交联的6%琼脂糖凝胶

孔径(Bead size

45-165μm

载量(Capacity

40mg 6×His-tagged protein/ml 基质

耐压(Tolerance Pressuremax

0.3MPa, 3bar

储存缓冲液(Buffer

20%乙醇的1×PBS

运输和保存方法

冰袋运输。4保存。有效期2年。

注意事项

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

(一)纯化流程

缓冲液的准备

缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22μm0.45μm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3

样品准备

2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)

1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。

2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSFPMSF在破碎前加入,其终浓度为1mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。

3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1mg/ml。【注】:如果表达的宿主细胞内含pLysSpLysE,可以不加入溶菌酶。

4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10μg/ml RNase A5μg/ml DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。

5)收集上述澄清蛋白液至离心管中,10000rpm4离心20-30min。取上清,置于冰上备用或-20保存。

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶,5000rpm离心10min,收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4下透析后方可上柱。

【注】:对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4下透析后上柱。

2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)

1)将培养液转移至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体去上清。

2)按照菌体:裂解液=1:10w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。

3)将破碎液转移至离心管,10000rpm4离心20-30min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。

4)按照菌体:裂解液(含8M尿素)=1:10w/v)的比例将包涵体充分悬浮。

5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

装柱

1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2cm的去离子水。

2)将树脂悬浮,小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3)如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。

4)打开层析柱底部出口,开启泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速,可以用所用泵的最大流速,这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后,在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。【注】:在随后的色谱程序中,不要超过最大装柱流速的75%

5)关闭泵,关闭层析柱出口。

6)如使用储液器,去除储液器,将分配器置于层析柱中。

7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。

8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如需要可重新调整分配器。

样品纯化

装柱后,可用各种常规的中压色谱系统,以AKTA使用为例进行说明:

1)将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞,连接至色谱系统中,打开下出口,将纯化柱连接到色谱系统中,注意旋紧。

23-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。

3)至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1ml/min5ml预装柱推荐流速为5ml/min

4)利用泵或注射器上样,收集流出液,以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。【注】:若样品粘度增加,即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压;上样量不要超过柱子的结合能力;大量样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。

5Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。

【注】:在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。

6Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。

7)建议用更高浓度咪唑(如500mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。

5 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。

(二)在位清洗

当填料使用过程中发现反压过高(>0.5Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-PlaceCIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液,接触时间为1-2h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

去除离子作用结合的蛋白

使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。

(三)填料再生

当填料使用过程中发现反压过高(>0.5Mpa),填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:

1)使用0.2M 醋酸溶液(含6M GuHCl)清洗2倍柱体积;

2)去离子水清洗5倍柱体积;

32%SDS清洗3倍柱体积;

4)去离子水清洗5倍柱体积;

5)乙醇清洗5倍柱体积;

6)去离子水清洗5倍柱体积;

7100mM EDTApH 8.0)清洗5倍柱体积;

8)去离子水清洗5倍柱体积;

9100mM NiSO4清洗5倍柱体积;

10)去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4备用。

附表1 HisSep Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况

试剂种类

浓度

还原剂

5mM DTE

0.5-1 mM DTT

20mM β-mercaptoethanol

5mM TCEP

10mM reduced glutathione

变性剂

8M urea

6M Gua-HCl

去污剂

2% TritonTM X-100(nonionic)

2% TweenTM20(nonionic)

2% NP-40(nonionic)

2% Cholate (anionic)

1% CHAPS (zwitterionic)

其他类

500mM imidazole

20% ethanol

50% glycerol

100mM Na2SO4

1.5M NaCl

1mM EDTA

60mM citrate

缓冲液

50mM sodium phosphate, pH7.4

100mM Tris-HCl, pH7.4

100mM Tris-acetate, pH7.4

100mM HEPES, pH7.4

100mM MOPS, pH7.4

100mM sodium acetate, pH7.4


附表可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer (pH8.0)

50mM NaH2PO4

300mM NaCl

10 mM imidazole

NaOHpH8.0, 0.22μm0.45μm过滤除菌

NaH2PO·2H2O    7.8g

NaCl             17.54g

Imidazole         0.68g

Wash Buffer (pH8.0)

50mM NaH2PO4

300mM NaCl

20 mM imidazole

NaOHpH8.0, 0.22μm0.45μm过滤除菌

NaH2PO·2H2O    7.8g

NaCl             17.54g

Imidazole         1.36g

Elution Buffer(pH8.0)

50mM NaH2PO4

300mM NaCl

250 mM imidazole

NaOHpH8.0, 0.22μm0.45μm过滤除菌

NaH2PO·2H2O    7.8g

NaCl             17.54g

Imidazole         17.0g

 

附表包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer (pH8.0)

8M Urea

100mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH8.0, 0.22μm0.45μm过滤除菌

Urea             480.5g

NaH2PO·2H2O    15.6g

Tris              15.76g

Wash Buffer (pH6.3)

8M Urea

100mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH6.3, 0.22μm0.45μm过滤除菌

Urea             480.5g

NaH2PO·2H2O    15.6g

Tris              15.76g

Elution Buffer(pH4.50)

8M Urea

100mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH4.5, 0.22μm0.45μm过滤除菌

Urea             480.5g

NaH2PO·2H2O    15.6g

Tris              15.76g

 

附表问题及解决方案

问题

可能原因

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

裂解液中可能含微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22μm0.45μm)过滤,或离心去除。

样品中含高浓度的核酸,延长破碎时间直至粘度降低,或添加DNaseI (终浓度为5μg/ml),Mg2+(终浓度1mM),冰上孵育10-15min

样品太黏稠

有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。

洗脱组分中无目的蛋白

蛋白可能是包涵体

可通过电泳检测裂解液,分析上清中是否有目的蛋白,包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式

表达量太低

优化表达条件,使用包涵体纯化缓冲体系

目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤中已被洗下来

提高Wash BufferpH值,或者降低咪唑浓度

目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来

降低Elution Buffer pH,或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度

使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到蛋白

蛋白降解

菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂

4下进行纯化操作

洗脱组分不纯(含多种蛋白)

洗杂不彻底

增加Wash Buffer 体积

样品中含有其他His标签蛋白

通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段(如去离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。

填料颜色变浅或变成白色

镍离子脱落或者剥离

按照填料再生的操作重新挂镍离子

填料呈现褐色

缓冲液中含有DTT等还原剂

参考附3适当降低还原剂DTT的浓度,或改用***

上样过程中蛋白发生沉淀

操作温度太低

室温下进行上样

 

蛋白发生聚集

在样品和所有缓冲液中添加稳定剂,如0.1%Triton X-100Tween-20

 

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产品名称

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20502ES10

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