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质粒小量提取试剂盒

质粒小量提取试剂盒

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产品名称: 质粒小量提取试剂盒

英文名称: 质粒抽提盒/质粒纯化盒/质粒抽提

产品编号: D1100-100

产品价格: 0

产品产地: 北京/solarbio

品牌商标: Solarbio

更新时间: null

使用范围: null

北京索莱宝科技有限公司--实验室产品
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质粒小量提取试剂盒说明书

货号:D1100

规格:50T/100T

保存:常温保存,复检期一年。

试剂盒内容:

试剂盒组成

D1100-50T

D1100-100T

RNase A

300ul

500ul

溶液Ⅰ

15ml

30ml

溶液Ⅱ

15ml

30ml

溶液Ⅲ

20ml

40ml

漂洗液

15ml

15ml×2

洗脱液

15ml

30ml

吸附柱

50个

100个

收集管

50个

100个

说明书

1份

1份


 

产品说明:

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。 离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。 使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入),混匀,置于 2-8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 

操作步骤:

1、取1-5ml细菌培养物,12000rpm离心1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3、向离心管中加入250ul溶液Ⅱ,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意:混匀一定要温和,以免污染细菌基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要超过5 min,以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入350ul溶液Ⅲ,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10 min,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,尽量不要吸出沉淀。注意:溶液Ⅲ加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

5、将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),室温放置2min,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入500ul漂洗液,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

8、12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

9、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置2min,12000rpm离心1min。

10、为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置2min,12000rpm离心1min。

注意事项:

1. 使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ 、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即拧紧盖子。

2. 洗脱缓冲液体积不应少于50ul,体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围), pH值低于7. 0会降低洗脱效率, DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。

3. 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,使用5-10ml过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。

4. DNA浓度及纯度检测:得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。 得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA、 40ug/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响吸光值,但并不表示纯度低。 

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