NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)试剂盒
产品名称: NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)试剂盒
英文名称: NADH Oxidase(NOX) Assay Kit
产品编号: BC0630
产品价格: 0
产品产地: 北京/中国
品牌商标: solarbio
更新时间: null
使用范围: null
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NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
BC0630-50管/48样 Solarbio 50管/48样 810.00元
产品简介:
NOX(EC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生,而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD,NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP,在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
试验中所需的仪器和试剂:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水
产品内容:
试剂一:液体50mL×1瓶,-20℃保存。
试剂二:液体10mL×1瓶,-20℃保存。
试剂三:液体1mL×1瓶,-20℃保存。
试剂四:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂五:液体6 mL×1瓶,4℃保存。
试剂六:粉剂×2瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存。
操作步骤:
一、样品测定的准备:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g,4℃离心5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的NOX(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于NOX活性测定。
二、测定操作:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至600nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)试剂四、试剂五和试剂六于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)在1mL石英比色皿中加入40μL样本、700μL试剂四、100μL试剂五和160μL试剂六,混匀,记录600nm处20s时吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
NOX活力单位的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX(U/104 cell)=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V反总:反应体系总体积,1mL; V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量;500:细胞或细菌总数,500万。