1、用pMET B质粒先做一下转化，把质粒转入感受态细胞内

2、将菌液涂到LB平板上倒置、过夜培养

3、挑取单克隆菌落，打入5毫升左右的液体LB，摇床12-16小时，吸取两毫升左右菌液，做一个小提，测浓度，跑胶，4、确定提出来之后，再用剩余菌液按1:100比例加入液体LB，摇床12-16小时

5、摇床结束后，用去内毒素的中提或者大提，可以留几毫升菌液加入适量甘油制成甘油菌冻-80，提出来的pMET B质粒就可以用于转染了。

如果想直接用甘油菌，那么只需要做第四第五步就行。

以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：

1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3

2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

pMET B质粒步骤如下：以24孔培养板为例：

1、转染前一天细胞换新的培养基

2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:

a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；

b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

c、将a+b的液体加在一起，pMET B质粒轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；

3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；

4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。

5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，pMET B质粒寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。

6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。XY3290 RNase抑制剂(人源) 400U|2500U

XY130699 RNase 抑制剂(小鼠源) 3000U

XY60201 非酶DNA清除剂 1.5mL

XY70801 非酶DNA清除剂-2 15次

XY90318 柱式DNA清除剂 50次

XY90802 大提柱式DNA清除剂 5次

XY90903 无RNase的DNase溶液 300U

XY90904 膜结合DNA清除试剂盒 50次

XY60204 非酶多糖清除剂(RNA专用) 10mL

XY100802 重蒸酚 100mL

XY3190 水饱和酚 100mL

XY3191 Tris饱和酚 100mL

XY100803 酸酚 100mL

XY100804 氯仿-异戊醇混合液 100mL

XY100805 酚-氯仿-异戊醇混合液 100mL

XY100935 超纯水 100mL

XY60604 DEPC水 100mL

XY80403 RNase-free水 10mL

XY71207 RNA洗脱液 50mL

蛋白质研究