磷酸果糖激酶测定试剂盒北京索莱宝科技有限公司

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性能参数

产品名称: 磷酸果糖激酶测定试剂盒
英文名称: Phosphofructokinase (PFK) Assay Kit
产品货号: BC0530
产品规格: 50管/48样
产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三
产品商标: Solarbio
价    格: 840元
保存与运输: 4℃保存或-20℃保存;
现货状态: 现货
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/9/11 8:35:00
浏览人数:57
诚信指数:1279点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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北京索莱宝科技有限公司
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北京市通州区马驹桥镇联东U谷景盛南四街15号85A三层
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010-56371281
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郭倩
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产品详细描述

产品内容:

提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体40mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存,临用前加入2.8mL双蒸水充分溶解备用;

试剂三:液体×1支,-20℃保存,临用前加入260μL双蒸水充分溶解备用;

试剂四:液体×1支,4℃保存,临用前加入260uL双蒸水充分溶解备用;

PFK工作液(可测25个样)的配制:取19mL试剂一和1.26mL试剂二充分混匀。

产品说明:

    PFKEC 2.7.1.11广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-***酸和ATP转化为果糖二***酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。

    PFK催化果糖-6-***酸和ATP生成果糖二***酸和ADP,丙***酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。

需自备的仪器和用品

    紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本的前处理

1、细菌、细胞或组织样品的制备

细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织处理:称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

二、测定步骤和加样表

试剂名称(μL

测定管

PFK工作液

800

样本

30

试剂三

5

试剂四

5

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,加样本的同时开始计时;在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中,准确反应10分钟;迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,记录1020秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2

注意事项

1、测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置,以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

4、若ΔA大于0.5,需将酶液用酶提取液稀释,使ΔA小于0.5,可提高检测灵敏度。

三、PFK活力单位的计算:

1、 血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-***酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二***酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/mL=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷V÷T=447.5×△A

2、 组织、细菌或细胞中PFK活力的计算:

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-***酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二***酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/mg prot)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(Cpr×V)÷T=447.5×△A ÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-***酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二***酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/g 鲜重)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(W×V÷V样总)÷T=447×△A ÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-***酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二***酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/104 cell)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(500×V÷V样总)÷T=0.895×△A

V反总:反应体系总体积,0.835×10-3LεNADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cmd:比色皿光径,1 cmV样:加入样本体积,0.03mLV样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,10minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

 

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