丙酮酸激酶测定试剂盒北京索莱宝科技有限公司

金牌供应商

性能参数

产品名称: 丙酮酸激酶测定试剂盒
英文名称: Pyruvate Kinase(PK)Assay Kit
产品货号: BC0540
产品规格: 50管/48样
产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三
产品商标: Solarbio
价    格: 560元
保存与运输: 4℃保存或-20℃保存;
现货状态: 现货
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/9/11 8:35:00
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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北京索莱宝科技有限公司
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北京市通州区马驹桥镇联东U谷景盛南四街15号85A三层
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18435223305
传真:
010-56371281
联系人:
郭倩
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北京·北京
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产品详细描述

产品内容:

提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体45mL×1瓶,4℃保存;   

试剂二:粉剂×1支,-20℃保存;

试剂三:粉剂×1支,-20℃保存;临用前每支加入1.5mL双蒸水充分溶解备用,用不完的试剂仍4℃保存一周    

试剂四:液体×1支,4℃保存;临用前每支加入900μL双蒸水充分溶解备用,用不完的试剂仍4℃保存一周。  

产品说明:

PKEC 2.7.1.40)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化糖酵解过程中的最后一步反应,是糖酵解过程中的主要限速酶之一,也是产生ATP的关键酶之一,因此测定PK活性具有重要意义。

PK催化***酸***酸和ADP生成ATP和丙***酸,乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙***酸生成乳酸和NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PK活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

操作步骤:

一、样本的前处理

1、 细菌或培养细胞:

先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个)提取液体积(mL)为500-10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或者200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、 组织:

    按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

3、 血清(浆)样品:直接检测。

二、测定步骤及加样表

1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2. 工作液的配置:临用前将试剂二转移至试剂一中,充分溶解待用;现配现用

3. 将工作液、试剂三置于37(哺乳动物)或25(其他物种)预热10分钟。

4. 加样表:

 

试剂名称(μL

测定管

工作液

900

试剂三

30

试剂四

15

样本

30

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,立即混匀,加样本的同时开始计时,在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中准确反应2分钟;迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,记录220秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2

PK活力单位的计算:

1、 血清(浆)PK活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PKU/mL=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷V÷T=2613×△A

2、 组织、细菌或细胞中PK活力的计算:

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PKU/mg prot)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(Cpr×V)÷T=2613×△A ÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PKU/g 鲜重)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(W×V÷V样总)÷T=2613×△A ÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PKU/104 cell)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(500×V÷V样总)÷T=5.226×△A

V反总:反应体系总体积,9.75×10-4LεNADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cmd:比色皿光径,1 cmV样:加入样本体积,0.03mLV样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,2minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

1、 测定过程中试剂四、样本在冰上放置,以免变性和失活。

2、 比色皿中反应液的温度尽量保持37℃25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、 最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

 

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