己糖激酶测定试剂盒北京索莱宝科技有限公司

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性能参数

产品名称: 己糖激酶测定试剂盒
英文名称: Hexokinase(HK) Assay Kit
产品货号: BC0740
产品规格: 50管/48样
产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三
产品商标: Solarbio
价    格: 620元
保存与运输: 4℃保存或-20℃保存;
现货状态: 现货
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/9/11 8:35:00
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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北京索莱宝科技有限公司
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北京市通州区马驹桥镇联东U谷景盛南四街15号85A三层
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产品详细描述

产品内容:

提取液:液体60mL× 1 瓶,4保存;   

试剂一:液体30mL× 1 瓶,4保存;

试剂二:粉剂× 1 4保存; 临用前加入30mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂4保存一周;

试剂三:液体5 mL× 1 瓶,4保存;

试剂四:粉剂×1支,- 20保存,用时每支加4mL双蒸水充分溶解备用,用不完的试剂4保存一周;

试剂五:粉剂×1支,- 20保存;用时每支加2mL 双蒸水充分溶解备用,用不完的试剂4℃保存一周;

试剂六:粉剂×1支,-20保存;用时每支加250μL试剂一和250μL蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂4℃保存一周;

产品说明

HK广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶,催化葡萄糖转化为6-***酸葡萄糖,6-***酸葡萄糖是糖酵解和***酸戊糖途径的交叉点。

HK催化葡萄糖合成6-***酸葡萄糖,6-***酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-***酸葡萄糖脱氢生成NADPH NADPH 340nm有特征吸收峰。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样品测定的准备:   

1. 细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500-1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10 的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

3. 血清(浆)样品:直接检测。

二、测定操作:

1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2. 试剂一、二、三、四和五置于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)预热10min

3. 加样表

试剂名称(μL)

测定管

试剂一

400

试剂二

400

试剂三

80

试剂四

80

试剂五

40

试剂六

8

样本

30

将上述试剂按顺序加入1mL 石英比色皿中,立即混匀,加样本的同时开始计时,在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37(哺乳动物)或25(其它物种)水浴或恒温箱中,准确反应5分钟;迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,记录520秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1

注意事项 

1. 如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三、四、五、六按比例配成混合液,预热10min

2. 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3. 最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。 

4. 不同匀浆组织中HK 活力不一样,做正式试验之前请做1- 2 只预试,若ΔA> 0.5,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数)或缩短反应时间至2min使ΔA< 0.5,以提高检测灵敏度。

HK活性计算:   

1、 血清(浆)HK活力的计算

单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

HKU/mL)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷V÷T=1113×ΔA

2、 组织、细菌或细胞中HK活力计算:

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

HKU/mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

HKU/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W ×V÷V样总)÷T=1113×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

HKU/104 cell)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总)÷T=2.226×ΔA

V反总:反应体系总体积,1.038×10-3 LεNADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.03 mLV样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,5 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

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