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如意连TM试剂盒A上海斯丹赛生物技术有限公司

性能参数

产品名称: 如意连TM试剂盒A
产品货号: 1901-010
产品规格: 10rxn
产品产地: 上海
产品商标: 斯丹赛
价    格: 询价元
保存与运输: -20oC保存一年。
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2015/7/20 10:18:00
浏览人数:1334
诚信指数:121点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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生物在线声明:以上所展示的信息由企业自行提供,内容的真实性、准确性和合法性由发布企业负责。生物在线对此不承担任何保证责任。

供应商联系卡

上海斯丹赛生物技术有限公司
地址:
上海市浦东新区哈雷路 998号4号楼
邮编:
电话:
021-58959719
传真:
021-58950719
联系人:
市场部
所在区域:
上海·上海
邮件:
公司展台:

产品详细描述

 一、产品组分

 

货号

组分

产品含量/规格

1921-010

10xBuffer A

20µL/tube

1

1911-010

Enzyme Mix A

20µL/tube

1

1930-010

Control insert

10µL/tube

1

 

ddH2O

500µL/tube

1

一、实验流程

注:目的片段PCR扩增时,通过引物设计时在5’端引入特定的酶切序列,图中以蓝色片段代替

 

 

5.1.制备PCR产物

    5.1.1设计扩增引物

引物设计原则:

1)确定目的片段中不含有GGTCTC酶切位点。

2)目的片段设计引物:PCR引物包括目的片段特异引物序列和酶切位点序列(注:目的片段的引物设计遵循引物设计原则即可

   正向引物(5’-3’): GGGGggtctctagtg +目的片段正向特异性引物序列

   反向引物(5’-3’):GCCGggtctcgtggg+目的片段反向特异性引物序列

    5.1.2 插入片段PCR扩增

目的片段PCR时注意事项:

1)酶的选择:插入片段可用任意PCR (Taq酶或高保真酶) 扩增,无需考虑产物末端有无A加尾。但推荐使用高保真聚合酶进行扩增,以减少扩增突变的引入。

2)反应条件:根据引物的退火温度及目的片段大小确定PCR反应程序。

3)建议进行PCR产物纯化。如果PCR片段是从质粒模板扩增的,且该质粒与重组载体具备相同的抗性,建议将PCR体系中的质粒模板用DpnI进行消化。

 

5.2.  如意连反应体系

Vector

1μl

Inserts

1-50ng

10x Buffer

2μl

Enzyme Mix A

1μl

ddH2O

加水至20μl

总体系

20μl

 

5.3. 连接反应

    体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)37℃反应10 min(亦可在室温条件下进行反应,但克隆数会减少数倍,而克隆正确率不会变化,建议尽量在37℃条件下进行反应),待反应完成后,可将反应产物直接进行转化;也可储存于-20,待需要时解冻转化。

 

5.4.  重组产物转化、涂板

1 10 μl连接反应液,加入到100 μl感受态细胞中,将溶液混匀,冰上放置30 min

242℃热激45秒,冰水浴孵育5 min

3) 加入500 μl SOC培养基,37℃摇菌30 min

4) 4000rpm离心5min,弃上清,留100 μl将沉淀打散,将菌液均匀涂布在含有卡那霉素的平板上。将平板倒置,于37℃培养12-16小时。

 

5.5.  阳性克隆鉴定

   1)测序:直接将2-3个细菌克隆,送给测序公司,使用通用引物进行测序。

   2)限制性内切酶酶切鉴定法:挑选2-3个细菌克隆接种于卡那霉素的液体培养基中,过夜培养。使用质粒抽提试剂盒提取质粒,根据载体信息选择适宜的限制性内切酶进行酶切鉴定。

 

l   Tips

1. PCR产物纯化后连接效率会更高。

2.提高PCR产物浓度,连接效率会更高。

3.在建议温度范围内(22-37),提高温度有助于提高连接效率。冬季室温较低,建议在水浴锅内37℃反应增加克隆数。

4.在第一次使用如意连试剂盒时,建议把试剂盒中的control insert也按说明书进行操作,完成连接反应,保证操作没有问题。

 

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