HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)上海钰博生物科技有限公司

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性能参数

产品名称: HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)
英文名称:  HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)
产品货号: 11104YB70
产品规格: 200T
试剂级别: 分子生物学级
产品产地: 中国/美国
产品商标: 钰博生物/Ybscience
价    格: 询价
保存与运输: RT,避光
现货状态: 80
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2018/12/1 15:46:00
浏览人数:368
诚信指数:2562点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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产品详细描述

  HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)

 产品信息

产品名称

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价格(元)

HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)

11104YB70

200T

-20

 

  HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)产品描述

HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR (+gDNA wiper)基于HieffTM Reverse Transcriptase Cat No. 11101ES84),该酶是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶,热稳定性提高,在50下活性最高,且可耐受高达55的反应温度,适用于具有二级结构的RNA模板的逆转录,能稳定可靠地合成cDNA

RNA模板首先用4 × gDNA wiper Mix短暂处理,可彻底去除残留的基因组DNA污染,保证后续的定量结果更加可靠,并且可简化qPCR引物设计,无需跨外显子/内含子仔细设计;随后直接加入5 × Super Mix II,即可立即进行逆转录。

5 × Super Mix II中含有逆转录反应所需的所有组分 (BufferdNTPHieffTM Reverse TranscriptaseRNase inhibitorRandom primers/Oligo dT primer mix) ,并可同时终止4 × gDNA wiper Mix,保证cDNA的完整性。RNA模板的体积最多可加到总体积的60%,非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。4 × gDNA wiper Mix5 × Super Mix II-20℃不会冻结,使用方便。

该产品适用于两步法RT-qPCR检测,针对qPCR进行特别优化,比例优化的Random primers/Oligo dT primer mix,使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始,最大程度保证了qPCR结果的可重复性。逆转录产物兼容SYBR®Green和探针法qPCR,可以根据实验目的,选择HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (Cat No. 11201ES03/11202ES03/11203ES03)HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix (Cat No. 11204ES03)等试剂配合使用,进行高性能的基因表达分析。

  HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)产品组分

编号

组分

产品编号/规格

1110470 (200T)

11104-A

RNase free ddH2O

1 ml×2

11104-B

4 × gDNA wiper Mix

400 μl

11104-C

5 ×Super Mix IIa

400 μl

11104-D

5 ×Control Mixb

40 μl

包含BufferdNTPHieffTM Reverse TranscriptaseRNase inhibitorRandom primers/Oligo dT primer mix

注:与HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(Cat No. 11103ES70)中的5 ×Super Mix成分不同,不可以混用。

除不含HieffTM Reverse Transcriptase外,其余成分与5 ×Super Mix II相同,用于配制对照反应。      

运输与保存方法

冰袋(wet ice)运输。产品在-20 ºC保存。

质量控制

所有组分经检测均无核酸外切酶,核酸内切酶,RNase残留。

功能检测:1 pg-1 μg HeLa cell total RNA为模板,测试qRT-PCR性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线,R2>0.990,斜率在-3.20-3.60之间;在1 μg HeLa cell total RNA中混入100 ng human genomic DNA,经gDNA wiper Mix处理后,进行qRT-PCR,对照反应的Ct>40

客户需要准备的材料

RNase free1.5 ml微量离心管或0.2ml PCR

水浴锅或PCR

RNA(高质量的完整的RNA对于获得高质量的cDNA是至关重要的)

  HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)操作步骤

1.基因组DNA去除

RNase free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min

RNase free ddH2O

to 8 μl

4 × gDNA wiper Mix

2 μl

模板RNA

Total RNA: 1 pg-500 ng

2.配制逆转录反应体系

在第1步的反应管中直接加入5 ×Super Mix II,用移液器轻轻吹打混匀。

5 ×Super Mix II

2 μl

1步的反应液

8 μl

3.对照反应(可选)

对照反应是指不加逆转录酶的逆转录阴性对照反应,用于检验RNA模板中是否有基因组DNA残留。在RNase free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。

5 ×Control Mix

2 μl

1步的反应液

8 μl

4.按下列条件进行第一链合成反应:

标准程序(可获得高质量的cDNA

25

10 min

42

30 min

85

5 min

或快速程序(适用于大多数RT-qPCR实验,效果与标准程序相当)

42

15 min

85

2 min

5.cDNA产物可在-20储存或立即用于qPCR反应。

第一链cDNA产物可直接用作qPCR反应的模板。建议作为模板的cDNA产物的体积不超过qPCR反应体积的1/10

可选择选择HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (Cat No. 11201ES03/ 11202ES03/ 11203ES03) HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix (Cat No. 11204ES03)作为qPCR试剂。


注意事项

14 × gDNA wiper Mix 5 ×Super Mix II5 × Control Mix含有高浓度的甘油,在使用前请短暂离心收集到反应管底部,并用移液枪轻轻吸打充分混匀后,准确吸取10 μl逆转录反应体系建议加入不超过500 ngTotal RNA。如果目的基因表达量非常低,最多加入1 μg Total RNA,否则加入RNA量过高,可能会超出后续定量PCR的线性范围。反应体积可根据需要等比例放大。

2)如果加入RNA模板体积较大 (如超过2 μl),请确保RNA是溶于水中而不是TE中,因为TE中的EDTA会对gDNA去除以及逆转录反应产生抑制。

3 可以不经过基因组去除步骤,直接用5 ×Super Mix II进行逆转录,这样所得到的结果会与使用与HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(Cat No. 11103ES70) 相当。但是,请勿将4 × gDNA wiper Mix11103ES70配套使用,因为11103ES70中所带的5 × Super Mix不含终止gDNA wiper反应的成分,有可能会影响后续的qPCR结果。

 

4)逆转录反应的快速程序适合于大多数RT-qPCR实验。一般情况下,结果与标准程序没有显著可见的差异。如果使用快速程序,发现目的基因的扩增效率较差,或者Ct值过大,则改用标准程序,以提高cDNA的产量。

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