人白细胞介素10 ELISA试剂盒

产品编号：SEKH0018

适用于人血清、血浆或细胞培养上清液等样本

背景介绍：

白细胞介素 10(IL-10)，也称为细胞因子合成抑制因子 (CSIF)，是一种多效性细胞因子，可以在多种类型细胞中发挥免疫抑制或免疫刺激的作用。人、大鼠和小鼠 IL-10 cDNA 序列均含 178 个氨基酸残基，内有 18 氨基酸信号肽序列，成熟 IL-10 分子为 160 氨基酸残基，小鼠和人 IL-10 分子中分别含 5 个和 4 个半胱氨酸残基，分子量为 35～40kDa。人和小鼠 IL-10 在 DNA 和氨基酸水平上分别有 81％ 和 73％ 的同源性。人 IL-10 可作用于鼠源性细胞，而小鼠 IL-10 对人的细胞则无交叉反应。在炎症反应方面, IL-10 能通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原Ⅱ (  MHCⅡ) 的表达，降低其抗原呈递作用，下调 T 淋巴细胞活性, 抑制炎性细胞的激活、迁移和粘附；同时，IL-10 也能抑制炎症因子的合成与释放，Rene 等发现，内源性与外源性 IL-10 均能在转录水平强烈抑制IL-1 、IL-6、IL-8、TNF-α 、粒-巨噬细胞集落刺激因子 ( GM-CSF) 和粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 的合成，从而起到抗炎的作用。

检测原理：

Solarbio (Solarbio ®) ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗人IL-10单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的人IL-10会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗人IL-10抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人IL-10发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的人IL-10，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的人IL-10浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中人IL-10的浓度。
 

样本收集及储存：

1. 1. 细胞培养上清：

将细胞培养基移至无菌离心管，在4℃条件下1000 ×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

1. 2. 血清样本：

室温血液自然凝固20 min后，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。

1. 3. 血浆样本：

将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合20 min，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。

试剂准备：

1. 试剂回温：首先在实验前30 min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。

2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。

3.标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)，首先将150mL 2000pg/ml高浓度标准品加入到850mL 300pg/ml的EP管中，轻轻涡旋60S，然后在其余六管中各加入500mL标准品/样本稀释液（SR1），按照以下浓度进行2倍稀释：150、75、37.5、18.75、9.375、4.68 pg/ml进行稀释。300pg/ml为标准曲线最高点浓度，标准品/样本稀释液（SR1）作为标准曲线的零点（0pg/ml）。复溶过的标准品原液（300pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱

4. 生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。

5.酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。

6. 洗涤方法：

l 自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为300ul/孔,注

与吸出间隔为30秒，洗板5次。

l 手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止30秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。

参考文献：

1. 1. Hirano, T. et al. (1984) J. Immunol. 133:798.
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8. 8. Von Stebut, E. (2000) Eur J Dermatol 17, 115-22.
9. 9. Danielpour, D. et al. (1989) Growth Factors 2:61.
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