Caspase-8活性测定试剂盒 100T  Caspase-8活性测定试剂盒 100T  Caspase-8活性测定试剂盒 100T

保存：试剂常温运输，到达后按要求储存，1 年内稳定。

Caspase-8活性测定试剂盒 100T产品内容：

（所示为 100 次检测，50 次检测试剂量减半

1. 裂解缓冲液 20ml,4ºC 保存；

2. 反应缓冲液 10ml,4ºC 保存；

3.2mMIETD-pNA 底物 0.5ml,-20ºC 避光保存；

4.10mMpNA 标准品 0.2ml,-20ºC 避光保存。

Caspase-8活性测定试剂盒 100T产品介绍：

Caspase-8 也称 FLICE、MACH 或 Mch5，通常以酶原的形式存在，凋亡时被激活，被认为是细 胞凋亡转导过程的上游 caspase。在 Fas-receptor 和 TNFR-1 介导的凋亡过程中 Caspase-8 被激活形成 二聚体，进而激活下游 Caspase-4,6,9,10。测定原理基于 Caspase-8 特异水解多肽底物 IETD-pNA (Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilide)，释放的游离**苯胺 pNA 在 405nm 有最大吸光度。采用可见光光 度比色法测定 pNA 而得到 Caspase 活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞 Caspase-8 活性。

所需仪器：

可见光分光光度计配 100μl 比色杯，或酶标仪。最佳波长 405nm，也可测 OD400~450nm 但灵 敏度略降。

操作步骤：

一、组织细胞准备：

Caspase活性测定值低，最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间点不恰当。 诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、 16、24小时，以检测最佳的观察点。通常2×107细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初 次测定时，单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×106细胞或2个孔的6孔板细胞。最少，单个测定 反应需加20μg蛋白对应于2×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和 leupeptin以免抑制Caspase活性。

1、裂解

（1）细胞裂解：1000g5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解， 冰浴10分钟，再次震荡。

(2) 组织裂解：3~10mg组织加100µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离 心管。

2、4ºC12,000g10分钟，取上清测定，或-70ºC保存。

3、蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml，相当于每10μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。

二、测定pNA标准曲线：

1.用反应缓冲液稀释 10mMpNA 标准品为 200,100,50,25,12.5,6.25,3.125μM。设置不加 pNA 的 零管。

2.每一浓度取 100μl 加入 96 孔板或 100μl 比色杯，测定 405nm 吸光度 OD 值。

3.每一浓度标准管 OD405 值为 x 轴，对应的 pNA 浓度为 y 轴，用 Excel 制作 pNA 浓度对 OD405 值的标准曲线。

三、样品测定操作：

1.按下表设置 96 孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对 照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。

2.盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37ºC反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此 时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失 去线性关系。

3.样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计 算其含量，并以蛋白浓度校正之。

4.测得的Caspase酶活性表示方法有两种。

(1) Caspase活性增加的百分比：100%× 实验处理组OD/ 实验对照组OD，简单而可靠。

(2) 样品Caspase酶活力单位/mgprotein，精确但计算较复杂，参见说明。

反应体系参考表 ( 允 许 适 当 调 整 样 品 加 样 量 )

                                  无样品空白对照          高酶活性样品          低酶活性样品

反应缓冲液μl                   95                              85                           60
待测样品μl                       －                              10                           35
底物 μl                              5                               5                              5
总体积μl                         100                           100                          100

产品说明：

1.Caspase酶活力单位定义：参考Chemicon公司Oneunitistheamountofenzymethatwillcleave1.0 nmolofthecolorimetricpNA-substrateperhourat37ºCundersaturatedsubstrateconcentrations。即当 底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37ºC1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据 pNA标准曲线和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。

2. 除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如 果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。

参考文献：

1. CohenGM.Caspases:theexecutionersofapoptosis.BiochemJ.326,1-16(1997).

2. PorterAGandJanickeRU.Emergingroleofcaspase-3inapoptosis.CellDeathDiffer.6,99-104 (1999).

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