Caspase-9活性测定试剂盒 50T北京索莱宝科技有限公司

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性能参数

产品名称: Caspase-9活性测定试剂盒 50T
英文名称: Caspase-9 activity test kit
产品货号: BC3890
产品规格: 50T
试剂级别: 生化级
产品产地: 北京
产品商标: Solarbio
价    格: 1104元
保存与运输: -20℃
现货状态: 现货
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/12/27 16:44:00
浏览人数:22
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产品详细描述

Caspase-9活性测定试剂盒 50T Caspase-9活性测定试剂盒 50T Caspase-9活性测定试剂盒 50T

Caspase-9活性测定试剂盒

品牌:Solarbio | 货号:BC3890

 

商品货号: 商品品牌: 规格 基本售价: 选择规格
BC3890-20T Solarbio 20T 62400元
BC3890-50T Solarbio 50T 1104.00元
BC3890-100T Solarbio 100T 1904.00元

 

Caspase-9活性测定试剂盒 50T产品内容: (所示为 100 次检测,50 次检测试剂量减半)
1. 裂解缓冲液 20ml, 4 ºC 保存;
2. 反应缓冲液 10 ml, 4 ºC 保存;
3. 2 mM IETD-pNA 底物 0.5 ml, -20 ºC 避光保存;
4. 10 mM pNA 标准品 0.2ml, -20 ºC 避光保存。
 
Caspase-9活性测定试剂盒 50T产品介绍
 
Caspase-9 也称 ICE-LAP6 Mch6,可与细胞色素 c Apaf1 形成复合物被激活,并进一步激活细胞凋亡的最关键酶 caspase-3,从而触发凋亡级联反应。Caspase-9 是凋亡信号转导过程中重要的上游 caspase,其激活可以通过***酸化进行调控。测定原理基于 Caspase-9 特异水解多肽底物LEHD-pNA (Leu-Glu-His-Asp-p-nitroanilide),释放的游离*****胺 pNA 405 nm 有最大吸光度。 采用可见光光度比色法测定 pNA 而得到 Caspase 活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞 Caspase-9 活性。
 
所需仪器:
 
可见光分光光度计配 100µl 比色杯,或酶标仪。最佳波长 405 nm,也可测 OD400~450 nm 但灵敏度略降。
 
Caspase-9活性测定试剂盒 50T操作步骤:
 
一、组织细胞准备:
Caspase活性测定值低,最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少,其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时,并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如02481624小时,以检测最佳的观察点。通常2×107 细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初次测定时,单个测定反应可加~200µg蛋白物对应于2×106 细胞或2个孔的6孔板细胞。最少,单个测定反应需加20µg蛋白对应于2×105 个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64leupeptin以免抑制Caspase活性。
 
1、(1)细胞裂解1000g 5分钟收集细胞,吸尽上清。每2~10×106 细胞加50~100µl裂解液震荡裂解,
冰浴10分钟,再次震荡。
(2) 组织裂解3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器,上下匀浆30次。转移匀浆液于离 心管。
 
24 ºC 12,000g 10分钟,取上清测定,或-70 ºC保存。
 
3、蛋白定量:Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml,相当于每10 µl待测样品含10-30µg蛋白,否则应增加细胞用量。
 
 
二、测定pNA标准曲线:
 
1.用反应缓冲液稀释 10mM pNA 标准品为 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125µM。设置不加 pNA 零管。
 
2.每一浓度取 100 µl 加入 96 孔板或 100µl 比色杯,测定 405nm 吸光度 OD 值。
 
3.每一浓度标准管 OD405 值为 x 轴,对应的 pNA 浓度为 y 轴,用 Excel 制作 pNA 浓度对 OD405 值的标准曲线。
 
三、样品测定操作:
 
1.按下表设置 96 孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高,可增加或减少样品。
 
2.盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC反应2小时,肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2,此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜,但酶活性较强时,孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
 
3.样品管OD405减去空白对照OD405,为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量,并以蛋白浓度校正之。
 
4.测得的Caspase酶活性表示方法有两种。
(1) Caspase活性增加的百分比:100% × 实验处理组OD / 实验对照组OD,简单而可靠。
(2) 样品Caspase酶活力单位/mg protein,精确但计算较复杂,参见说明。
 
反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)
          无样品空白对照      高酶活性样品       低酶活性样品
反应缓冲液 µl                   95                                 85                               60
待测样品 µl                        -           10                                35
底物 µl                                   5                                  5                              5
总体积 µl      100     100     100
 
Caspase-9活性测定试剂盒 50T产品说明:
 
1.Caspase酶活力单位定义:参考Chemicon公司One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 ºC under saturated substrate concentrations。即当底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37 ºC 1小时水解pNA底物,产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线和样品OD值,可计算出Caspase酶活力单位。
2. 除了处理组外,可设置阳性凋亡诱导剂组,阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂( 果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
 
Caspase-9活性测定试剂盒 50T参考文献:
 
1. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 326, 1-16 (1997).
2. Porter AG and Janicke RU. Emerging role of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 6, 99-104 (1999).

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