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T7耐热高产RNA合成试剂盒

T7耐热高产RNA合成试剂盒

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产品名称: T7耐热高产RNA合成试剂盒

英文名称: T7耐热高产RNA合成试剂盒

产品编号: HZ0604A

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产品产地: 中国/上海

品牌商标: 沪震生物

更新时间: 2023-08-17T10:24:20

使用范围: null

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 T7耐热高产RNA合成试剂盒

描述:T7 耐热高产 RNA 合成试剂盒可在体外高效合成多 种类型的 RNA,如 mRNA、lncRNA、shRNA 等。利用 T7 RNA 聚合酶 2.0识别T7 promoter(TAATACGACTCA CTATA G G)以方框中 G 碱基为起点开始转录,该试剂 盒可以将少量样本进行高效转录,单次反应可获得高达 150 μg 的产物,转录长度可达 5000nt 以上。利用该试 剂盒得到的 RNA 适用于多种下游应用,如 RNA 结构和 功能研究、核酸酶生物化学研究、RNase 保护分析探针、 印迹杂交、反义 RNA 及 RNAi 实验、微阵列分析、显 微注射、体外翻译和 RNA 疫苗等。 T7 耐热高产 RNA 合成试剂盒使用方便,有利于用户 快速建立反应。本试剂盒还配备了 DNase I,在 RNA 合 成完毕后可快速去除 DNA 模板,便于获得高纯度转录 RNA。组分中含有 T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0 可在 37-52℃条件下进行高效的体外转录,最佳温度为 37℃, 50℃反应条件下仍然保留 50%以上的活性。这种高温的 反应特性有益于以下几个方面的实验:(1)提升了 GC 含 量较高 RNA 的转录效率;(2)提升了长片段 RNA 的合 成能力;(3)在使用帽类似物时,提高了共转录的加帽效 率;(4)减少了 dsRNA 副产物的形成,降低了合成 RNA 的免疫原性。 原理: 组分: 名称 10T 50T 5×T7 Transcription Buffer 1ml 1ml # T7 2.0 Transcript Enzyme Mix 20 μl 100 μl rNTP Mixture(25mM each) 40 μl 200 μl RNase Free DNase I(10U/μl) 20 μl 100 μl 10×RD Buffer 1ml 1ml RNase Free H2O 1 ml 1 ml # 每 2μl 的 T7 2.0 Transcript Enzyme Mix 含有 100U T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0、20U Rnase Inhibitor、0.02U 热 稳定无机焦磷酸酶。 保存:-20℃可保存 2 年,避免反复冻融。 操作步骤: (1) 按以下组分配制反应液 5×T7 Transcription Buffer 4 μl 转录模板 DNA 0.2~1 μg rNTP(25mM each) 3.2 μl T7 2.0 Transcript Enzyme Mix 2 μl RNase Free H2O upto 20 μl 注:DNA 模板应为线性化 DNA, 无 RNase、蛋白、盐、 EDTA、A260/280 值在 1.8-2.0. (2)37℃-50℃反应1~3h,转录RNA产量在80~150μg。 (3) 转录完毕后,如需去除模板 DNA,20μl 反应液中 加入 5μl 的 10×RD Buffer、2μl 的 RNaseFree DnaseI 、 23μl 的 RNase Free H2O 至 50 μl,37℃孵育 15min。 (4)整个反应完毕后可取 0.2~0.5μl 转录产物进行电泳 检测,并采用 5min RNA Purification Kit 进行 RNA 的纯化(或经典 LiCl 沉淀法纯化), 并保存于-80℃。

T7 RNA 聚合酶对T7噬菌体启动子具有高度的特异性,并可以其作为启动子,DNA作为模板体外合成正义链或反义链RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA 聚合酶的底物模板,因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。 正义或反义RNA链取决于模板DNA序列与T7启动子的位置,DNA位于T7启动子的下游,T7 RNA聚合酶会转录出正义RNA,反之则为反义RNA链。

提供两种T7 RNA 聚合酶:野生型和耐热型。野生型T7 RNA 聚合酶可在37℃对模板进行高效体外转录,与野生型噬菌体 T7 RNA 聚合酶相比,T7耐热RNA聚合酶可在更高的温度下进行体外转录。它可在37-52℃条件下进行高效的体外转录,最佳温度为37℃,50℃反应条件下仍然保留50%以上的活性,而野生型在此温度下无活性。基于此耐热的体外转录反应特性具有以下优势:(1)提升了GC含量较高RNA的转录效率;(2)提升了长片段RNA的合成能力;(3)在使用帽类似物时,提高了共转录的加帽效率;(4)减少了 dsRNA 副产物的形成,降低了合成 RNA 的免疫原性; (5)提升NASBA和CRISPR核酸扩增检测性能。该系列酶均来自重组 E.coli BL21菌株纯化而得,无核酸酶污染。

T7耐热高产RNA合成试剂盒是基于T7 耐热RNA聚合酶而组建的试剂盒,产量超过 MegaScript T7 Transcription kit,可在体外高效合成多种类型的 RNA,如mRNA、lncRNA、shRNA等。利用T7 RNA 聚合酶2.0识别T7 promoter(TAATACGACTCA CTATA G G)以倒数第二个G碱基为起点开始转录,该试剂盒可以将少量样本进行高效转录,单次反应可获得高达150 μg 的产物,转录长度可达5000nt以上。利用该试剂盒得到的 RNA 适用于多种下游应用,如RNA结构和功能研究、核酸酶生物化学研究、RNase保护分析探针、印迹杂交、反义 RNA 及 RNAi 实验、微阵列分析、显微注射、体外翻译和 RNA 疫苗等。

应用

  • 制备放射标记的 RNA 探针
  • 合成用于体外翻译的 RNA
  • 合成用于结构、加工和催化性能研究的 RNA
  • 合成 RNA 反义链,调控基因表达

1X T7 Transcription Buffer

40 mM Tris (pH 7.8), 20 mM NaCl, 18mM MgCl2,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT 。

酶储存液

10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100 , pH 7.5。

储存

-20°C可保存2年,避免反复冻融。

热失活

75°C,10min。

注意事项

1. 转录DNA模板的种类:推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。
2. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RnaseA会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板。
3. 该酶对高浓度NaCl或KCl不耐受,当其浓度高于 150mM时,其活性受到显著抑制(~50%)。
4. 在20μl反应体系中加入0.02U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量(提高25~50%)。

实例

1.野生型和耐热型T7 RNA聚合酶的耐热性能比较
以20ng DNA作为模板,分别在反应体系(20 μl)中加入100U的T7 RNA聚合酶和T7 耐热RNA聚合酶2.0进行体外转录,结果可见T7 耐热RNA聚合酶2.0在50°C仍具有较高活性,而野生型T7 RNA聚合酶在该温度下没有活性。
T7耐热RNA聚合酶
2.热稳定无机焦磷酸酶对转录产量的影响
在反应体系(20 μl)中加入0.02U的热稳定无机焦磷酸酶(货号C5007)可显著提高转录产物的产量。
T7耐热RNA聚合酶
3.以不同大小的线性化质粒作为模板,应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试
由结果可见:T7耐热RNA聚合酶2.0在50°C条件下仍具有理想的转录活性。
T7耐热RNA聚合酶
4.以不同大小的PCR产物作为模板,应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试
由结果可见:T7耐热RNA聚合酶2.0可有效转录>5000nt的RNA分子。
T7耐热RNA聚合酶

 

 

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