DNA 5-羟甲基胞嘧啶图谱测定上海希匹吉生物技术有限公司

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技术服务信息

服务名称:DNA 5-羟甲基胞嘧啶图谱测定
服务类别:分子生物学服务 - 其它
价格:询价
允许参观:协商决定
所在区域:上海.上海
更新时间:2017-12-15 9:58:00
浏览人数:62
诚信指数:474点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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上海希匹吉生物技术有限公司
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技术服务详细描述

5hmC检测.docDNA中5-羟甲基胞嘧***图谱测定及在临床中的应用

技术参数
名称:5-羟甲基胞嘧***基因图谱测定和分析
技术名称:nano-hmC-Seal,来源于芝加哥大学何川教授实验室
DNA用量:1ng~1ug(具体情况会根据5hmC在该物种中的含量进行小范围调整)
测序策略:NextSeq500/Hiseq X10,PE38/PE150
数据量:平均1.5G/6G,读段数量2千万以上
周期:少量样本(<10)25个工作日给出基本解读分析;批量样品根据实验要求协商数据循环周期。

服务范围
各类物种或者其他来源DNA中的5-羟甲基胞嘧***基因图谱绘制和对比分析;
各类肿瘤临床研究,包括肿瘤标记物的寻找、组织活检、液体活检、术后***和用药指导的研究;
专业人员辅助实验设计,定制个性化的5-羟甲基胞嘧***科研方案;

技术背景简介
    5-羟甲基胞嘧***(5hmC)是5-甲基胞嘧***(5mC)的主动去甲基化过程中的重要中间产物,被称为“第六种DNA碱基”。2009年两篇science文章发现了TET酶可以将5mC氧化成5hmC并在生理上发挥着重要的作用,5hmC也迅速成为科研的热点。在接下来的几年中,科学家发现5hmC和5mC一样,是一种重要的表观遗传修饰。5hmC的基因分布可以精准对应基因活性调控,比5mC更加动态灵敏地反应基因表达状态。2012年时,《Cell》杂志就有文章报道羟甲基胞嘧***与黑色素瘤之间的紧密关系(Lian et al., 2012)。随后又有多篇有影响力的学术文章进一步验证了羟甲基胞嘧***作为细胞发育、神经系统、肿瘤以及心血管疾病等的标记物。

    同表观遗传修饰5mC一样,结合高通量测序的方法绘制特定情形下5hmC在全基因组上的基因图谱显得尤为重要。通过了解DNA中羟甲基化胞嘧***在基因组上的分布,可以对应分析基因组的调控信息。
    我们的DNA羟甲基化检测技术原理来自于2011年美国芝加哥大学何川教授发表在NatureBiotechnology的专利技术(Song et al., 2011)。该技术是利用糖基转移酶的作用将含有叠氮基团的葡萄糖特异性的共价标记到片段化DNA的5hmC上,然后再通过高效的点击化学反应接上biotin进行可实现高效的富集并构建DNA文库;利用高通量测序并比对分析的方法即可以获得5hmC在基因组上的分布情况。对于抗体富集的方法,该方法的富集效率更高,5hmC的基因图谱更加精确。
    2016年,何川教授实验室对该技术细节进行了优化,其nano-hmC-Seal的技术可检测低至1000个细胞基因组中的5hmC修饰分布情况(Han et al., 2016)。他们利用该技术检测白血病模式小鼠中造血干细胞的5hmC图谱,发现5hmC分布在白血病样品与野生型样品中有显著差异,并获得了不同类型造血干细胞中的羟甲基化差异性区域的序列特征(如下图所示)。基于nano-hmC-Seal技术,我们实现了5hmC标记并富集等流程的标准化操作,具有极高的灵敏度,精准稳定的检测来源更为广泛的DNA样本:1),从DNA使用量上看,该技术可操作低至1ng的游离核酸,高至1ug的组织样本DNA;2),结合高通量测序,该技术可以分析任意物种中含有5hmC修饰的DNA样本,进而分析其生理调控机制。
   


服务特色
该技术检测灵敏度极高,样品收集方便,起始样本量少;标准化流程操作,避免因操作造成的偏差;
表观遗传新领域,全基因组比对,获取全基因组的羟甲基化分布,信息量大;
根据个性化科研方案提供专业的且具有特色的数据分析,满足发表文章的要求。

技术开发流程
采集样本-运输质检-提取DNA-文库构建-5hmC富集扩增-质控测序-数据解读-数据报告并反馈
数据分析
基本解读:测序数据比对至基因组,给出样本在基因区域的羟甲基化含量分布
深度解读:在对照组与实验组之间进行统计分析,找出羟甲基化含量分布的显著差异,出具报告辅助临床诊断与治疗。

样本要求
人:8ml外周血或者相关组织样品,及其相关临床资料(性别、年龄、基本诊断等,作为临床分析用);
其他物种:组织样品DNA或者较大量的血液。
临床应用举例
1、DNA的5-羟甲基胞嘧***修饰在结直肠癌液体活检中的研究应用。
为了寻找5hmC作为结肠癌临床诊断中的潜在价值,我们分析比较结直肠癌患者和健康志愿者的细胞游离DNA(cfDNA)中5hmC的含量分布并尝试寻找肿瘤标记物。我们基于改进的nano-hmC-Seal技术对53名健康志愿者和38名结直肠癌患者的血浆样品中cfDNA进行5hmC修饰分布的检测。这些生物样品收集后被分成两批,在第一批样品中分析寻找癌患和健康人之间具有显著性差异的5hmC基因位点并进行回归模型构建,并在第二批样品中进行效果验证。最后我们也分析通过判定的分数对于癌症病理分期和预后效果的相关性进行一定的研究。
第一批样品中有14例癌症和18例正常对照,第二批样品有24例癌症和35例正常对照。在第一批样品的cfDNA中,通过对比健康对照组和癌症组样品中5hmC的基因图谱差异,我们分析出7,976个有显著差异性的5hmC基因位点,将这些差异性位点中5hmC升高和降低最多的各前50个位点用来进行分层聚类分析,可以有效地把第二批样品中的癌症和健康个体分离开来(如图A)。与传统生物标记进行比较,包括癌胚抗原CEA,糖类抗原724,和糖类抗原125,cfDNA中基于5hmC分布的肿瘤标记物在肿瘤诊断上明显有更高的灵敏性和特异性(5hmC诊断有92%的灵敏度,而传统生物标记的综合灵敏度只有45.7%)。这样的结果已经接近于金标准肠镜的检测效果。
A.

    我们进一步利用这些5hmC 差异性位点进行分析,建立回归模型,对第二批样品做癌症分类,并生成受试者工作特征曲线(ROC)。在第二批样品的病人分类中,这种预测算法达到了92%灵敏度和86%的特异性(曲线下面积AUC=0.96)(如图B 左)。

B.

    最后,利用回归模型对所有的癌症术前样品和两例癌症术后样品进行分数判定,以0.5为阈值的情况下,我们结合判分和癌症样品的病理分期进行作图(图B右),发现随着病理分期的发展(I~III期),该模型给出的结果基本上呈正相关趋势,IV期样本由于癌细胞已经发生转移,其肠癌细胞的特性已经发生改变因而无法准确判分。意料之中的是经过手术且肠镜诊断未复发的患者样品也同样判定为健康状态。
这些结果说明通过血液中5hmC的肿瘤标记物筛查,我们可以高选择性高灵敏性的分出肠癌患者和健康患者,并且对于癌症患者的预后和复发***,该回归模型能给出明确的指导。

2、5-羟甲基胞嘧***在结直肠癌组织样品中的DNA修饰差异研究。
    为了进一步研究癌症组织与健康组织的差异,我们获取了配对的癌症组织和癌旁组织并进行了5hmC的基因图谱检测。结果如图C,由显著性差异的位点做聚类分析形成的热图清晰的显示了结直肠癌癌症组织与癌旁组织中的基因表达调控的差异。这些结果对于后续研究中进一步揭示癌症的发生、发展机制和癌症治疗提供了铺垫。
C.

参考资料
Han, D., Lu, X., Shih, A. H., Nie, J., You, Q., Xu, M. M., . . . He, C. (2016). A Highly Sensitive and Robust Method for Genome-wide 5hmC Profiling of Rare Cell Populations. Mol. Cell, 63(4), 711-719. doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.028
Lian, C. G., Xu, Y., Ceol, C., Wu, F., Larson, A., Dresser, K., . . . Shi, Y. G. (2012). Loss of 5-hydroxymethylcytosine is an epigenetic hallmark of melanoma. Cell, 150(6), 1135-1146. doi: 10.1016/j.cell.2012.07.033
Song, C. X., Szulwach, K. E., Fu, Y., Dai, Q., Yi, C., Li, X., . . . He, C. (2011). Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Biotechnol, 29(1), 68-72. doi: 10.1038/nbt.1732

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