流式凋亡检测上海锐赛生物技术有限公司

银牌供应商 

技术服务信息

服务名称:流式凋亡检测
服务类别:细胞生物学服务 - 细胞培养服务
价格:1000元
允许参观:允许参与实验
所在区域:上海.上海
更新时间:2018/5/18 13:34:00
浏览人数:10
诚信指数:3025点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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上海锐赛生物技术有限公司
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传真:
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技术服务详细描述

 实验原理

细胞凋亡(Cell apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下的损伤,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡检测的方法很多,我们采用的Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的原理:***脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性***脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行EGFP融合、荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针。(如下图7.4所示)。


7.4 Annexinv检测细胞凋亡的原理


***化丙***(Propidine lodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但可进入凋亡中晚期的细胞和死细胞,而使细胞核红染。Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡,可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及死细胞区分开。

 

技术应用

细胞凋亡研究不仅受到基础医学界的重视,也日益受到临床医学领域的青睐。通过检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响,在肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都发挥着积极的作用。


实验流程

 

 

 

 

  实物 数据信息 实验周期
客户提供

细胞株(冻存株或培养细胞)

及所需药品

细胞培养信息和药物处理方式

3周

 

我们提供 剩余药物

基本实验步骤、细胞培养照片、

流式上机图片、数据分析结果


实验结果展示

 

图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡


TROUBLESHOOTING

 

实验问题

原因

推荐解决方法

空白细胞凋亡率高?

操作不当

操作动作轻柔,收完样后尽快上机。

检测试剂量过大,信号过强

降低试剂用量。

采用Annexin V/PI双染

法检测凋亡诱导后的阳

性对照样本凋亡率偏低?

试剂盒过期

4℃保存时间不要超过半年。

荧光淬灭

操作过程中注意避光,加完染料之后最后在2h内检测。

丢弃细胞培养上清

细胞培养上清中含有漂浮细胞,丢弃后造成凋亡比例偏低。


常见问题FAQ

 

Q :常用的细胞凋亡的检测种类有哪些?

A :凋亡检测方法有数十种之多,主要可以分为以下几大类: 1) DNA水平,检测凋亡时基因组DNA的变化; 2)蛋白水平,主要检测凋亡时线粒体和死亡受体两大凋亡通路的变化; 3)细胞膜/细胞器膜水平,主要检测凋亡时细胞膜成分或者膜电位的变化; 4)超微结构,主要检测凋亡时亚细胞结构的变化。这些方法各有优缺点,必须结合具体的实验目的,实验条件以及实验处理来选择合适的分析手段。

 


Q :常见的细胞亡检测方法及优缺点比较?

 

方法

优点

缺点

Anexin VPI双染法:

Annexin v可结合凋亡细胞外翻的PS

蛋白。

可以准确的进行凋亡细胞的计数。

反应完毕后需在一小时内检测,贴壁细胞吹打处理要轻柔,防止机械损伤对实验结果的影响。不能用于组织样本。

Sub G1 峰检测:

凋亡细胞DNA含量的流式细胞计划分析,分析DBA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

适用性广,操作方便。

对实验操作及实验结果的分析能力要求较高。不能用于组织样本。

TUNRL法:

染色体DNA双链断裂或单链断裂而产

生大量的粘性3‘ -OH末端,可在脱氧

核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用

下,对DNA的3’ 末端进行荧光剂标记。

原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,特别适用于组织样本的凋亡研究。

操作要求高,组织样本需要固定,固定方式不好可能导致背景高、信号弱。

Caspase等凋亡通路蛋白的WB检测:未活化前以酶原形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段被剪切激活,可裂解相应的胞浆、胞核底物,最终导致细胞凋亡。

WB检测方便快捷,实验结果相对直观,可进行半定量检测。

注意购买质量好的抗体并优化检测条件。


Q: Annexin V/PI双染实验的四个象限分别代表什么?

 

PI

Annexin V

代表细胞群

LL象限

-

-

正常细胞

LR象限

- +

早期凋亡细胞

UR象限

+ +

晚期凋亡细胞或者坏事细胞

 

UL象限

+ -

理论上不会出现细胞;若出现有可能是操作过程中受到损害的细胞或是FACS仪器参数设置不当










A:根据费光情况划分四个象限(见图7.6) ,横坐标代表绿色光(Annexin V为FITC绿色光标记),纵坐标代表Pl红色荧光,四个象限分别命名为LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿过未凋亡细胞和凋亡早期细胞的细胞膜,而Annexin V可以检测到凋亡早期外翻的PS,因此四个象限代表了不同的细胞群。

图7.6流式四象限图

 

Q:流式上机检测细胞亡每次所需要的细胞量大概是多少?

A:细胞接种到6孔板中进行前期药物处理/转染/感染后备用。对于个体比较大的细胞,依据实际细胞密度,使用150pxt培养血培养细胞,最终进行检测需10^5-10^6个细胞。


参考文献

1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.

2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.


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