transwell技术服务基尔顿生物科技(上海)有限公司

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技术服务信息

服务名称:transwell技术服务
服务类别:细胞生物学服务 - 细胞培养服务
价格:电询
允许参观:允许参与实验
所在区域:上海.上海
更新时间:2019/4/23 8:43:00
浏览人数:11
诚信指数:194点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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基尔顿生物科技(上海)有限公司
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技术服务详细描述

 transwell技术服务

transwell技术服务
一类有通透性的杯状的装置;其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,杯子底层的一张有通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜)。该膜微孔的大小在0.1-12.0µm之间。
Transwell放入培养板后,分为两室:Transwell小室内称上室,盛装上层培养液;培养板内称下室,盛装下层培养液。上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
 

transwell技术服务应用
细胞种在上室内,因聚碳酸酯膜有通透性,故可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
根据transwell的特点(孔径,膜),可进行如下方面研究:
1.共培养                   孔径<3.0um
研究下室细胞B代谢物(分泌物)对上室细胞A的影响。
2.细胞趋化               孔径可选择5.0、8.0、12.0µm
研究进入下室的细胞量,反映下室成分对上室细胞的趋化能力
3.细胞迁移               孔径常选择8.0、12.0µm
研究进入下室的细胞量,反应上室细胞的迁移能力
4.细胞侵袭               孔径常选择8.0、12.0µm,膜上室侧铺有基质胶,
研究进入下室的细胞量,反映上室细胞的侵袭能力
 
具体应用例子
一、肿瘤细胞侵袭实验(transwell)
原理:
模仿体内细胞外基质,细胞只有分泌基质金属蛋白酶(MMPs),降解基质胶才可进入下室。
 
步骤
1.  Transwell小室准备
1)无基质胶Transwell小室制备
A. 包被基底膜:
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀释,无血清培养基作为稀释液
B. 取适量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul),4℃操作。
C. 37℃培养箱中,孵育4-5h(>5h);出现“白色层”时,说明已经变为固态。
 
2)有基质胶Transwell小室制备
A. 小室放入培养板中,上室加入300µl预温的无血清培养基
B. 室温下静置15-30min,使基质胶再水化
C. 再吸去剩余培养液。
 
2.细胞悬液准备
1)消化、收集细胞;
2)PBS洗1-2次
3)用含BSA的无血清培养基重悬(细胞密度约在1-10×105/ml)。
 
3. 细胞接种
1)取适量细胞悬液加入Transwell小室(按transwell说明)。24孔板小室一般200µl。
2)24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基。注意避免气泡产生(下层培养液和小室间)
3) 培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。
 
4. 结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法:
1 ) 直接计数法
“贴壁”细胞计数:
 “贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色,可在镜下计数细胞
A. 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. 染色:常用的0.1%结晶紫染色。
优点:(1) 不需固定细胞,直接染色即可。
(2) 配制简单方便。
(3) 可以用33%醋酸脱色,测量洗脱液OD570值,间接反映细胞数
注意,染色前要将膜风干,否则可能会染不上。
C. 细胞计数:
(1) 显微镜进行观察和拍照
(2) 取3-5个视野计数细胞个数
 
2) 间接计数法
用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数。
MTT法
A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基,将小室浸没于其中,置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500µl DMSO,将小室浸没于其中,振荡结晶充分溶解。
D. 取出小室,测所得DMSO的OD值。
结晶紫检测
A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. (可选)甲醛固定30分钟,室温
B. 24孔板中加入500µl  0.1%结晶紫溶液,将小室浸没于其中,室温放置20分钟
C. 24孔板中加入500µl 33%醋酸,将小室浸没于其中,脱色。
D. 取出小室,测量洗脱液OD570值。
优点:染色和脱色的过程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。
 
5. 注意点
①Transwell小室:
注意是否是预先铺好胶
② 上层培养液:
上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,一般加入0.05%-0.2% BSA。
③ 细胞:
有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。
④ 基质胶:
常用的是人工重构基底膜材料Matrigel
⑤ 下层培养液:
下层常用含5%-10% FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。
⑥ 细胞培养板:
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
 
二、肿瘤细胞迁移实验(Transwell)
过程与Transwell侵袭实验基本一致,不同的只是不需要铺Matrigel。
步骤
1.Transwell放入预先每孔加有600ul的培养基(含10%血清)的24孔板内,
2.在Transwell的内室加入细胞(100ul,用含0.1%血清的培养基稀释到所需密度),
3.放入细胞培养箱,培养一定时间后取出。
4.取出Transwell,用棉签擦去膜(内室一侧)的细胞
5.另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟
6. 结晶紫染色20分钟,
7. PBS或清水洗3次,
8.显微镜下观察细胞,记数。

目前,基尔顿生物科技(上海)有限公司,主营实验技术服务、SCI论文服务、动物模型构建、细胞株、elisa试剂盒等,欢迎广大科研爱好者前来咨询选购!

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