【基因编辑】服务之一：CRISPR/Cas9基因敲除

简介
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来，能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中，进行有效的靶向编辑，具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。
CRISPR/Cas9系统中sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strand break, DSB），机体自身通过非同源重组（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除（Gene Knockout）。
其中Cas9可根据不同菌属来源及大小进行分类，目前得到广泛应用的有SpCas9和SaCas9，SpCas9来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶，由1368个氨基酸组成，可识别的PAM序列为NGG ，由于构建载体载量过大，因此所选择的病毒载体有限，通常构建在慢病毒载体上；SaCas9是来源于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的Cas9核酸酶，由1053个氨基酸组成，可识别的PAM序列为NNGRRT，比SpCas9小25%，能够进行AAV病毒的包装，适用范围更广。

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）
    
非同源重组修复DSB（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）

应用
CRISPR/Cas9基因敲除细胞系建立
CRISPR/Cas9基因敲除建立动物疾病模型

技术优势

1. 操作简易：仅需Cas9核酸酶和sgRNA即可对目标基因靶位点进行切割；
2. 效率高：在基因组水平上编辑目标基因，高度模拟目标模型，可精确编辑基因组；
3. 作用靶位点多：可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除；
4. 提供多种基因编辑病毒工具：AAV、LV；
5. 提供 BSL-1 和 BSL-2 病毒注射及实验操作平台；
6. 全面的实验技术支持。

1. sgRNA的设计；
2. 细胞内sgRNA剪切活性筛选；
3. 敲除载体的构建；
4. 依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式：

5. 筛选基因敲除单克隆细胞系。

                                                                                                        

1. Wiles M V , Qin W , Cheng A W , et al. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J]. Mammalian Genome, 2015, 26(9-10).
2. Wang H , Yang H , Shivalila C , et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering[J]. Cell, 2013, 153(4):910-918.