慢病毒构建稳转细胞系武汉枢密脑科学技术有限公司

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技术服务信息

服务名称:慢病毒构建稳转细胞系
服务类别:分子生物学服务 - 病毒转染系统服务
价格:询价
允许参观:允许参与实验
所在区域:湖北.武汉
更新时间:2019/11/19 9:55:00
浏览人数:72
诚信指数:531点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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武汉枢密脑科学技术有限公司
地址:
武汉市东湖高新技术开发区光谷七路128号 中科开物产业园枢密脑科学技术有限公司
邮编:
430074
电话:
15327213341
传真:
027-65023363
联系人:
李娟
所在区域:
湖北·武汉
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技术服务详细描述

稳转细胞系构建
定义
稳转细胞系(稳定表达细胞株)指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上,使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后,通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细胞中经细胞克隆挑选得到的,由一个细胞扩增得到的细胞株。单克隆细胞株性状统一,传代过程中细胞的基因表达保持稳定。
枢密科技慢病毒采用三质粒系统转染293T细胞包装慢病毒颗粒,将Gag/Pol和载体分开,并且使用VSV-G的膜蛋白,包装出来的慢病毒宿主范围广,是基因转导的理想工具。
科研和临床应用
在基因劝能的研究中,稳定表达细胞株弥补了在一些功自B实验中瞬时感染(或转染)由于外源基因表达时间短的缺陷,便于长期观察基因对于细胞功能的影响以及蛋白质间相互作用。
服务流程
基因/模板DNA合成+载体构建+慢病毒包装+收获病毒液+q-PCR检测病毒滴度测定+慢病毒稳转细胞株筛选=稳转细胞株
单克隆细胞系筛选     
对感染并筛选后的细胞进行稀释培养,挑取单一细胞生长而成的细胞克隆,再进行扩大培养,以获得性状单一,表达稳定的细胞株。
   1.将细胞消化后接种于96孔板中,接种的细胞密度为1个孔;
   2标记出具有单个细胞的孔,将Puromycin浓度减至维持浓度(筛选浓度的1/2-14),继续筛选和扩增;
   3.扩增完毕后,收集细胞进行qPCRWestem Blo鉴定,选择鉴定结果正常的单克隆细胞冻存保种。
混合克隆细胞系筛选
  Puromycin浓度减至维持浓度(筛选浓度的1/2-1/4),继续对感染后的细胞进行筛选和扩增,同时收集细胞进行qPCRWestem Blol鉴定(鉴定目的基因表达水平),并将鉴定结果正常的细胞冻存保种。
最终交付
慢病毒病毒滴度检测报告;稳转细胞株;实验报告,包括实验流程、测序结果和峰图、引物序列、载体图谱和滴度测定报告和q-PCR稳转株的检测等。

稳定细胞系构建

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