细胞增殖及活性检测武汉巴菲尔生物技术服务有限公司

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技术服务信息

服务名称:细胞增殖及活性检测
服务类别:细胞生物学服务 - 其它
价格:询价
允许参观:允许参与实验
所在区域:湖北.==所在城市==
更新时间:2019/11/11 14:32:00
浏览人数:86
诚信指数:550点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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武汉巴菲尔生物技术服务有限公司
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张小丹
所在区域:
湖北·==所在城市==
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公司展台:

技术服务详细描述

MTT细胞增殖及活性检测

定义:MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二***基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

原理: MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤***敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

一般实验方法:

普通MTT法实验步骤:
1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul。
2:培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul。继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解。
4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物MTT法实验步骤
贴壁细胞:
1:收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
2:5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔。建议设5个,否则难以反应真实情况
3:5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4:每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5:终止培养,小心吸去孔内培养液。
6:每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7:同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

MTT主要有两个用途

 1.药物(也包括其他处理方式如***线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;
 2.细胞增殖及细胞活性测定。  

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