细胞自噬整体解决方案深圳市拓普生物科技有限公司

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技术服务信息

服务名称:细胞自噬整体解决方案
服务类别:科研实验整体外包服务 - 整体实验服务外包
价格:询价
允许参观:允许参与实验
所在区域:广东.深圳
更新时间:2020/4/3 10:24:00
浏览人数:98
诚信指数:515点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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技术服务详细描述

细胞自噬(autophagy or autophagocytosis):又称为Ⅱ型细胞死亡,是细胞在自噬相关基因(autophagy related geneAtg) 的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。自噬作为时下的研究热点,有非常深远的研究意义。拓普生物在自噬研究方面具有丰富的经验,我们可以为您提供从课题设计-实验操作-实验结果-数据分析的整体解决方案。

自噬诱导剂
1Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激;
2
Carbamazepine/ L-690330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单***酸酶);
3
Earle's 平衡盐溶液:制造饥饿;
4
N-Acetyl-D-sphingosineC2-ceramide):Class I PI3K Pathway 抑制剂;
5
RapamycinmTOR 抑制剂这是最常用的);
6
Xestospongin B/CIP3R 阻滞剂。


自噬抑制剂

13-Methyladenine3-MA):(Class III PI3K hVps34 抑制剂;
2
Bafilomycin A1:质子泵抑制剂;
3
Hydroxychloroquine(羟氯喹)。

细胞自噬形态学特征的检测方法

1)透射电镜观察自噬体。

    自噬体是自噬的标志性结构。自噬体属于亚细胞结构,直径一般为300900nm,平均500nm,普通光镜下看不到。通过透射电子显微镜发现自噬体一直是观察自噬现象最直接、最经典的方法,是自噬检测的“金标准”。


2)荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成。

    由于自噬体膜形成过程中需要LC3,因此通过标记LC3可以识别自噬体。


3)荧光染色法

    用荧光染料对组织切片或细胞进行染色观察自噬的发生。晚期自噬体与溶酶体融合而呈酸性,根据这个特点可用酸向性染料MDC、吖***橙和Lyso Tracker标记自噬溶酶体。


自噬标志性蛋白
1自噬标记蛋白LC3

    微管相关蛋白1轻链3(LC3Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的LC3C端被Atg4蛋白酶剪切,成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当自噬体形成后,LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰。与自噬体膜表面的***脂酰乙醇胺(PE)偶联,成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜,因此LC3-/Ⅰ比值的大小可以估计自噬水平的高低。


2)细胞自噬底物蛋白的检测

         p62偶联于LC3,作为一种调节因子参与自噬体的构成,在自噬的中、晚期被降解。细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负相关。蛋白质免疫印迹技术检测p62水平的降低可以反映自噬活性程度。p62的增加暗示着自噬、溶酶体降解途径被抑制。


3Atg12-Atg5复合体 

    除了LC3,自噬体膜上标志性蛋白质还有Atg12-Atg5结合体。Atg12Atg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起,它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。


4Beclin1 

    哺乳动物Beclin1是酵母Atg6基因的同源物。Beclin1通过激活自噬对细胞生长和抑瘤机制进行控制。蛋白质印迹技术检测Beclin1蛋白表达情况直接反映自噬活性。


5自噬相关的标志性蛋白还包括ATG1ATG9DRAM1ATG14ATG16以及 ATG18等。

自噬的调控通路

1)依赖mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶点)途径的自噬

API3K-AKT-mTOR信号通路


 B. AMPK-TSC 1/2-mTOR 信号通路

2其它的信号通路

A. 3-甲基腺嘌呤(3-MA)通过抑制Class PI3K的活性抑制自噬;

 B. beclin1UVRAG作为正调控子,抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成ClassPI3 复合物调控自噬;

C. GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬;GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬;

D. 死亡相关蛋白激酶(death-associated proteinlinase,DAPK)和DAPK相关蛋白激酶(DAPK-related protein kinase-1,DRP-1)诱导自噬。

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