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乙肝造模服务武汉枢密脑科学技术有限公司

技术服务信息

服务名称:乙肝造模服务
服务类别:其它服务 - 其它
价格:具体详询
允许参观:允许参与实验
所在区域:湖北.武汉
更新时间:2022/5/23 14:47:00
浏览人数:21
诚信指数:536点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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武汉枢密脑科学技术有限公司
地址:
武汉市东湖高新技术开发区光谷七路128号 中科开物产业园枢密脑科学技术有限公司
邮编:
430074
电话:
18140661572
传真:
027-65023363
联系人:
何晓斌
所在区域:
湖北·武汉
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技术服务详细描述

乙肝造模

一、背景
     乙肝病毒 (Hepatitis B virus , HBV) 属于嗜肝DNA病毒科(Hepadanaviridae),具有很强感染性,通过在宿主细胞核内形成共价闭环的DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 而稳定存在。慢性乙肝病毒感染可导致严重肝脏病变或衰竭,甚至造成癌症。虽然通过接种乙肝疫苗可以有效预防HBV的感染,但现有疗法不能完全清除病毒,全世界仍有约2.57亿(3.5%)人口感染HBV,其中非洲、中东、中国和东南亚以及西太平洋地区感染率较高,共计约2.35亿人口,存在巨大的新疫苗及新药研发的需求缺口1,2
     现有乙肝治疗药物主要为逆转录酶抑制剂和干扰素,患者需长期用药,一旦停止用药病毒就会重新爆发。2018年11月,FDA发布的抗乙肝病毒感染药物开发指南提出,开发新型乙肝疗法的目标是“在治疗结束后较低的病毒复发和肝脏疾病进展风险”3,这意味着临床前药物评估需要在能模拟乙肝病毒长期感染的动物模型中进行。然而乙肝病毒宿主范围狭窄,目前用于研究的乙肝动物模型有人HBV树鼩模型及人HBV黑猩猩模型。但是人HBV自然感染树鼩存在如感染指标检测结果重复性和稳定性差、感染持续时间短、感染率低等方面的问题,而黑猩猩属于濒危动物,因此,利用HBV直接感染的动物模型局限性很大。于是,研究者们把目光转向了遗传背景单一的模式动物小鼠,由于小鼠缺乏HBV受体,不能用直接感染的方法建模,而rAAV(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体安全性高、宿主细胞范围广,利用rAAV载体携带HBV全长基因组经尾静脉注射导入小鼠,可实现动物肝脏的持续感染。该造模方法具备诸如适用范围广、均一稳定、成功率高、量效关系明显、制备简单等优点。

二、产品描述
      乙肝病毒基因组为松散的环状双链DNA(relaxd circular DNA, RC DNA),在宿主细胞核内形成cccDNA作为转录模板,形成乙肝病毒扩增所必需的前基因组RNA (pregenomic RNA, pgRNA),再依次经反转录形成负链DNA、DNA复制形成双链DNA,完成病毒基因组的扩增过程。2009年,韩国延世大学Wang-Shick Ryu教授课题组首次报道了通过AAV携带乙肝病毒基因组的方式模拟乙肝病毒感染的过程4,5枢密科技利用AAV基因组能在宿主细胞中稳定存在的特性以及8型AAV强嗜肝性的特点,开发了携带1.3拷贝HBV全长基因组的腺相关病毒产品rAAV-HBV1.3-mer WT replicon此产品携带了血清型为ayw、基因型为D型的乙肝病毒基因组,其模拟了pgRNA的形成,更贴近病毒天然的生活周期,能稳定的建立乙肝病毒长期感染的状态,加速抗乙肝药物研发的进程

1. 分子构建
图1 用于建立乙肝病毒感染动物模型的rAAV-HBV1.3-mer WT replicon产品基因组结构示意图,包含完整乙肝病毒基因组的4个开放读码框和上游重复区域。

2. 效果验证
     通过小鼠眼眶采血检测血清中乙肝病毒标记物HBsAg、HBeAg和DNA含量。结果显示rAAV-HBV1.3-mer WT replicon注射后3-4d即可检测到乙肝病毒的表达,且表达时间持续7周,实验结果稳定,个体差异性小。
图2 用rAAV-HBV1.3-mer WT replicon建立小鼠乙肝病毒长期感染模型效果测试。A-C,不同剂量病毒尾静脉注射,检测血清乙肝病毒标记物含量,每个剂量组检测5只小鼠。D-F,最高剂量组5只小鼠乙肝病毒标记物个体检测结果。

三、质控
     枢密的生产系统、质控系统都严格按照标准文件执行,可确保产品质量和批次间的稳定性。该系统不含人源细胞系,避免了生产过程中产生野生型HBV病毒颗粒的风险,安全性更高。此系统可实现大规模的生产,而且具有较高的产率和稳定性。
     腺相关病毒产品采用***克沙醇密度梯度离心纯化,通过荧光定量PCR检测AAV基因组ITR序列测定滴度(见图3),并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)银染检测产品纯度,如图4所示,rAAV-HBV1.3-mer WT replicon三条特征条带清晰,纯度≥97%。
图3 通过qPCR检测,rAAV8-1.3xHBV的滴度为1012 vg/mL。


图4  SDS-PAGE银染检测rAAV-HBV1.3-mer WT replicon纯度,AAV的外壳由VP1、VP2、VP3三种蛋白按1:1:10比例组成,大小分别是87 KD、73 KD、62KD,三条带灰度值越接近上述比例,病毒纯度越高。

四、产品信息


五、使用环境及注意事项

1、重组腺相关病毒属于复制缺陷型假病毒载体,但rAAV-HBV1.3-mer WT replicon携带致病基因,其病毒产品和受感染的动物对人具有感染性和致病性,应在生物安全二级条件下操作使用,运输过程也需做到隔离防护。
2、操作人员需要经过专业的生物安全培训并获得生物安全培训合格证,严格按照生物安全实验规程和手册进行操作。建议操作人员接种乙型肝炎疫苗以获得乙肝免疫能力。
3、感染了rAAV-HBV1.3-mer WT replicon的小鼠排泄物等可能含有HBV病毒,该HBV病毒对包括人在内的灵长类动物有潜在感染性和致病性,对树鼩、鸭子等动物的均具有感染性,故实验动物及废弃物的处理需要严格遵循生物安全实验规程。
4、该病毒产品及其动物模型的使用单位应该有生物安全二级实验室资质。

六、运输及保存方法
1、病毒采用干冰运输,通常1-2天送达。
2、病毒可在4℃短期保存1-2周,但滴度会有4-5倍的降低。长期保存需存放于-80℃。每冻融一次,病毒滴度降低10%左右,应避免反复冻融。
3、理论上,病毒可于-80℃保存6个月以上,但病毒储存时间超过6个月后,建议在使用前重新测定滴度。
4、分装保存,避免反复冻融。
5、避免细菌、蛋白酶等污染。

七、参考文献
[1] Ganem D. Hepadnaviridae. The viruses and their replication [M] . // Fields B N,Knipe D M, Howley P M. Fields virology. 3rded. Philadelphia: Lippincott-Raven Publisher, 1996: 2703-2737.
[2] GLOBAL HEPATITIS REPO RT. 2017.
[3] Chronic Hepatitis B Virus Infection: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry. FDA. 2018.
[4] Haifeng Wang, Seahee Kim, and Wang-Shick Ryu. DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Inhibits Hepatitis B Virus Reverse Transcription by Incorporation into Nucleocapsids. Journal of General Virology (2009). 5815-5824.
[5] Man-Young Cha, Dong-Kyun Ryu. Stimulation of hepatitis B virus genome replication by HBx is linked to both nuclear and cytoplasmic HBx expression. Journal of General Virology (2009). 90: 978-986.

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