高通量R-loop脱靶检测

高通量R-loop脱靶检测简介

碱基编辑技术 (base editing)是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因编辑技术，目前依据碱基编辑酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器 (cytosine base editor, CBE)和腺嘌呤碱基编辑器 (adenine base editor, ABE)。碱基编辑技术因其高效、不依赖DNA双链断裂产生、无需供体DNA参与等优势，已经成功应用在各种动物、植物及其他生物中，为基因治疗及精准作物育种等领域提供了重要技术支撑。

然而，研究发现早期版本的CBE会在胞嘧啶脱氨酶的作用下在全基因组范围产生一种低频率Cas9-非依赖型的DNA或RNA的脱靶突变，严重影响单碱基编辑在基础生物和临床研究中的应用。基于此，我们公司提供了一种快速、便捷、经济的CBE脱靶效应的检测技术—高通量R-loop脱靶检测，是单碱基编辑中不可或缺的脱靶检测方法，也是广大科研人员进行CBE编辑器筛选的利器。相比于传统的全基因组测序，R-loop高通量脱靶检测省时省力，经济实惠，可用于规模化的评估和筛选。

利用CBE作用于单链DNA的特性，通过nSaCas9在编辑靶点外的基因组区段诱导R-loop，从而人为制造单链DNA（ssDNA）区域，可放大CBE系统在特定位点的Cas9非依赖型脱靶频率。若CBE的脱氨活性在这些区域产生脱靶编辑，可通过高通量测序进行富集检测，从而评估CBE编辑器的Cas9非依赖型脱靶效应。

实验流程

应用场景

（1）对于科研来讲，目前CBE发展迅猛，存在不同来源的胞嘧啶脱氨酶，如rAPOBEC1、AID、CDA1等，同时多项研究对这些脱靶酶进行定向进化，以降低其脱靶效应。可通过R-loop的方法检测改造后变体的脱靶效应，以筛选最优变体；

（2）对于临床转化来讲，脱靶效应是基因治疗中必须关注的问题。通过R-loop的方法检测CBE的脱靶活性是评估临床转化安全性的重要手段。

服务优势

（1）直接在活细胞体内进行检测，切割效率和脱靶效应更加符合实际；

（2）灵敏度高：能检测Cas9非依赖型低频脱靶突变，包括DNA突变和RNA突变；

（3）准确性高：检测结果可通过实验验证；

（4）更短的服务周期：从质粒构建、准备细胞到最终可视化结果呈现，仅需一月。

数据分析

送样要求

（1）可提供目标基因序列，由我公司免费设计sgRNA；

（2）若客户提供sgRNA序列，可由我公司构建sgRNA质粒；或客户提供sgRNA质粒即可，由我司进行转染及后续建库测序，实验用细胞系由客户提供；

（3）若提供转染后的DNA，则需要DNA样品总量：5ug以上，浓度50ng/ul以上。DNA样品纯度：OD260/280=1.8~2.0。DNA样品完整性：DNA无明显降解，需提供凝胶电泳检测胶图。

（4）如需我司进行一体化服务，可向我司咨询详情。

服务内容