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各类实时定量PCR技术服务-LncRNA-PCR/circRNA-PCR/microRNA-PCR/mRNA-PCR/MeDIP-PCR/ChIP-PCR等上海康成生物工程有限公司

技术服务信息

服务名称:各类实时定量PCR技术服务-LncRNA-PCR/circRNA-PCR/microRNA-PCR/mRNA-PCR/MeDIP-PCR/ChIP-PCR等
服务类别:分子生物学服务 - 实时定量PCR服务
价格:请询价400-886-5058;800-820-5058
允许参观:不允许参与实验
所在区域:上海.上海
更新时间:2018/11/14 9:52:00
浏览人数:7939
诚信指数:972点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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上海康成生物工程有限公司
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800-820-5058/ 400-886-5058(免费热线);021-64451989
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market@kangchen.com.cn
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技术服务详细描述

 各类实时定量PCR技术服务

服务类型有:LncRNA-PCR技术服务、circRNA-PCR技术服务、microRNA-PCR技术服务、mRNA-PCR技术服务、MeDIP-PCR技术服务、ChIP-PCR技术服务

一、LncRNA-PCR 技术服务
    LncRNA是目前生命科学以及医学研究领域中的研究热点之一。由于LncRNA具有一些重要的分子特征,在进行实时定量PCR检测的时候需要更为精细的实验设计:

    可变剪接:大部分的LncRNA在成熟过程中,经过剪接步骤。一些LncRNA在这个过程中形成剪接异构体,这些异构体的表达具有组织特异性,其中部分具有不同甚至相反的生物学功能,因此需要对LncRNA进行转录本特异的检测。
    长链反义非编码RNAlong antisense ncRNA):大约50%的蛋白编码基因的基因组区域能够转录形成长链反义非编码RNA. 这些RNA分子转录方向和蛋白编码基因相反,没有蛋白编码能力,是LncRNA的重要组成部分。 sense转录本和antisense转录本可能具有不同的生物学功能,然而基于oligo(dT)或随机引物的标准RT-PCR方法缺乏链特异性,不能将两种转录本进行有效区分,得到的数值是两个转录本的总表达量。如图所示:经过第一轮PCR 反应后,sense转录本和antisense转录本产生相同的双链DNA产物,下游的PCR 反应无法进行区分。

 

*图释:  应用oligo (dT) 和随机引物的RT-PCR反应不具有链特异性
 

康成生物为您提供LncRNA 实时定量PCR技术服务,通过转录本特异性的引物设计以及链特异性的RT步骤解决LncRNA PCR检测中的难点。高效,专一地精确定量样品中的LncRNA表达量。您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,康成生物专业的技术服务人员就可替您完成LncRNA实时定量PCR实验操作和数据分析,提供给您完整的实验报告,为您节省大量的时间和精力。

康成实例-1--- LncRNA qPCR 
    Dlx-5/6超保守区域转录形成两个剪接异构体LncRNA: Evf-1和Evf-2. Evf-2能够和Dlx-2蛋白结合形成稳定的复合物,进而刺激Dlx-5和Dlx-6的表达;而Evf-1功能未知。为了精确检测这两个LncRNA,我们在可变剪接位点设计了转录本特异的引物。如图2所示。

*图释:Evf-1和Evf-2的引物设计。绿色箭头代表的引物针对Evf-1设计,紫色箭头代表的引物针对Evf-2设计,红色的引物位于两个转录本共有的部分是非特异性引物所以不被选用。
 
康成实例-2--- LncRNA qPCR
    BACE1是是阿兹海默症病理学中的关键酶,催化Aβ蛋白形成,在阿兹海默病人的样品中表达量上升。BACE1基因DNA反义链上转录形成LncRNA  BACE1-AS. 细胞和活体实验证明 BACE1-AS具有调控BACE-1 mRNA稳定性的功能,因此能促进BACE-1蛋白的表达。准确检测BACE1-AS的表达量,是研究该LncRNA分子功能的关键。链特异性地RT反应,仅将靶标转录本(BACE1-AS)反转录成cDNA, 排除了反义链转录本带来的干扰。
 
*图释: 在RT步骤中选用链特异性地引物,仅检测BACE1-AS。
 
康成生物LncRNA实时定量PCR技术服务流程:
1. 引物设计、合成及测试
    a. 从权威数据库(Refseq, UCSC known gene, ensemble, 相关文献)中得到非编码RNA的序列,屏蔽SNP及重复序列。
    b. 在引物设计软件中,调整引物的设计位点,将引物设计在转录本特异的区域,如: exon-exon的连接点附近。然后根据PCR的反应条件,优化引物参数,如 Tm值,产物大小,二级结构,引物二聚体等。
    c.  通过和数据库blast比对,降低引物非特异性扩展的可能性。
    d. 通过实验对引物的扩增效果进行测试。
2. 样品RNA抽提及RNA质量检测
    a. 紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值,获得RNA的浓度并通过 A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
    b. 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
3. 逆转录合成cDNA
    利用链特异性的反转录引物进行RT反应,合成cDNA。
4. 实时定量PCR
    以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增。同时检测每个样品中内参基因的表达量,校正上样误差。
5. 分析结果、提供实验报告
    分析实时定量PCR结果,提供实验报告,包括详细的实验方法,实时定量PCR实验数据和图表
 
 
二、circRNA-PCR 技术服务

    circRNA是目前生命科学领域新兴的研究热点分子之一。区别于传统的线性RNA,circRNA具有独特的闭合环状结构,使得其对核酸酶不敏感,所以比线性RNA更为稳定,非常适合作为临床诊断标志物(biomarker)。近期研究表明,circRNA主要通过吸附miRNA抑制后者对相应靶基因的调控,称之为竞争性内源RNA(ceRNA),而与疾病相关联miRNA的相互作用说明circRNA对疾病的调控起着非常重要的功能。

康成生物为您提供一站式的circRNA实时定量PCR技术服务,您只需要提供保存完好的组织或细胞样本,本公司专业技术服务人员就可为您完成circRNA实时定量PCR实验操作和数据分析,提供您完整的实验报告,为你节省大量的时间和精力。

 
circRNA实时定量PCR技术服务流程
1. 独特的引物设计
   
 由于circRNA独特的闭合环状结构,在进行实时定量PCR检测的时候需要更为特异的引物设计;针对circRNA特异的back splicing site,引物设计在该位点两侧(如下图),即“外向引物”(区别于线性RNA的内向引物)。

 
 
2. 样品RNA抽提
    a.组织样本:取适量(50-100mg)新鲜组织或正确保存的组织样本,匀浆后用Trizol试剂抽提RNA。
    b.细胞样本:取1×106-1×107细胞,PBS清洗细胞,吸去PBS后用Trizol试剂抽提RNA。
3. RNA质量检测
    a.紫外线吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值,获得RNA的浓度及并通过  A260/A230及A260/A280的吸收比值判定RNA的纯度;
    b.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
4. 逆转录合成cDNA
    利用random primer进行RT反应,合成cDNA。
5. 实时定量PCR
    以合成的cDNA作为模版进行实时定量PCR扩增;同时检测每个样本中内参基因的表达量,校正上样误差。
6. 分析结果、提供实验报告
    分析实时定量PCR结果,提供实验报告,包括详细的实验方法、实时定量PCR实验数据和图表。
 
 
三、microRNA-PCR 技术服务
    实时荧光定量PCR技术是在普通PCR反应体系中加入荧光试剂,利用荧光信号实时检测PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。成熟microRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA,由于长度太短,不能通过传统的实时定量PCR进行检测。本公司通过特殊设计的茎环结构的反转录引物,配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平,也可以用终点PCR法定性检测。
 

 康成生物为您提供microRNA实时定量PCR技术服务,您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,本公司专业的技术服务人员就可替您完成microRNA实时定量PCR实验操作和数据分析,提供给您完整的实验报告,为您节省大量的时间和精力。


康成客户实例——microRNA qPCR
Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Circulation, 2011.
    研究者首先采用Exiqon miRCURY LNA™芯片(v11.0)检测13例高血压患者和5例健康人血浆样本的microRNA表达谱,发现27个表达差异的microRNA。随后对第二组24例高血压患者和22例健康人的血浆样本,应用实时定量PCR方法对芯片筛选出的表达有变化的microRNA进行验证(见下图)。PCR结果和芯片结果一致。并进一步在第三组,194例高血压患者和97例健康人的血浆样本中应用实时定量PCR方法对挑选出的重要microRNA进行检测。发现与健康人相比,HCMV编码的hcmv-miR-UL112在高血压患者的血浆中表达明显上调。

   

上图: microRNA qPCR验证microRNA芯片数据。从microRNA芯片数据挑选了20个差异表达的microRNA,利用荧光定量PCR进行验证,结果显示与microRNA芯片得出的表达趋势基本一致。红色表示健康人样本,绿色表示高血压病人样本,microRNA的表达量经过snRNA U6归一化。

康成生物microRNA实时定量PCR技术服务流程
1. 引物设计、合成
设计并合成目的microRNA的茎环RT引物、PCR引物和检测用荧光探针,并合成该microRNA相应的DNA寡核苷酸作为标准。
2. 样品RNA抽提
a.组织样品:取适量(50~100mg)新鲜组织或正确保存的组织样品,匀浆后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
b.细胞样品:取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,吸去PBS后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
3. RNA质量检测
a.紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值,获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
b.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
注:用于microRNA实时定量PCR检测的RNA样品,必须高纯度、完整,没有RNase 污染(降解的样品不能用于实时定量PCR检测),同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
4. 逆转录合成cDNA
利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。
5. 实时定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增,梯度稀释的标准同时进行实时定量PCR扩增,根据Ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中U6 snRNA含量作为内参,校正上样误差。
6. 分析结果、提供实验报告
分析实时定量PCR结果,根据标准曲线定量样品中的目的microRNA。提供实验报告,包括详细的实验方法,实时定量PCR实验数据和图表。
 
四、mRNA-PCR 技术服务
 
     实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异、验证基因芯片和siRNA干扰的实验结果。
 

康成生物为您提供的一站式mRNA实时荧光定量PCR技术服务,您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,本公司专业的技术服务人员就可替您完成mRNA实时定量PCR实验操作和数据分析,提供给您完整的实验报告,为您节省大量的时间和精力。全部实验皆使用进口试剂完成;定量PCR仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪ABI PRISM 7900、Corbett Research公司生产的离心式实时定量PCR仪Rotor-Gene 3000。

康成生物mRNA实时定量PCR技术服务流程
1. 设计并合成Realtime PCR引物
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR® Green)的PCR反应的优化。
3. RNA抽提
    a. 若实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。
    b. 若实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。
4. RNA质量检测
   
a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度。
    b. 使用甲醛电泳试剂(ambion)进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
5. cDNA合成
   
 按照逆转录酶(Invitrogen或Promega)5. 使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品(可选)
    进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增, 其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7. 实时定量PCR
   
 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBead热启动聚合酶来自Promega公司),进行RealTime PCR扩增和检测
8. 数据分析
   
检测结果进行标准曲线分析,以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 提供实验报告包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果及相关图表。

五、MeDIP-PCR 技术服务

    实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR)是在PCR反应体系当中加入荧光试剂,利用荧光信号积累实时检测PCR的进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一,灵敏,快速,高重复地精确定量起始模板的浓度。
    康成生物将实时定量PCR技术与MeDIP技术完美结合。首先通过MeDIP技术富集甲基化的DNA片段,然后利用实时定量PCR技术进行检测,最后经过数据分析处理得到检测的生物样品中特定位点的甲基化水平的精确数值。

MeDIP-qPCR技术特点
• 高特异性,针对感兴趣的基因启动子或CpG岛设计实时定量PCR引物
• 超宽的线性范围,可跨越7个数量级
• 精确度高,重复性好
• 灵敏度高

康成生物MeDIP-qPCR技术服务流程
A. 将基因组DNA 超声打断成400bp-500bp片段
B. 加热变性,并将变性后的单链DNA样品分为两份
C. 其中一份单链DNA样品加入抗5’-甲基胞嘧***抗体,另一份作为Total input DNA样品
D. 使用亲和层析分离C步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物,样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱。纯化得到甲基化DNA片段(MeDNA-IP DNA)
E. 实时定量PCR检测

实验数据处理
•  Total input DNA样品作为模板,用待测基因特异性引物进行qPCR检测得到Ct (input)
•  MeDNA-IP DNA样品作为模板进行检测得到Ct (IP)
•  待测基因甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)的效率(MeDIP / Total input)可通过以下公式计算:
   %(MeDIP / Total input)= 2^[ Ct (input)- Ct (IP) ] X 100

康成客户实例----MeDIP-qPCR
Quantitative detection of multiple gene promoter hypermethylation in tumor tissue, serum, and cerebrospinal fluid predicts prognosis of malignant gliomas. Neuro Oncol., 2010.
    研究人员利用MeDIP-qPCR技术检测发现,在不同恶性神经胶质瘤病人的肿瘤组织,血清和脑脊髓液样本中,MGMT, p16INK4a, TIMP-3,和 THBS1四个基因启动子区域都发生了高甲基化,而且血清和脑脊髓液的DNA甲基化水平与肿瘤组织基本一致(见下图)。通过与临床生存数据关联分析发现,MGMT, p16INK4a和THBS1的甲基化水平可以作为独立的预测因子用于肿瘤的预后分析。因此血清或脑脊液中这些基因的甲基化有望成为新的肿瘤标志物,同时检测这些基因的甲基化水平也为恶性胶质瘤病人的化疗方案选择和预后分析提供了新的理论依据。


上图:MeDIP/Input值表示DNA甲基化水平的高低;圆圈代表不同的病人样本;黑色短线是有效区分病人预后好和差的甲基化阈值。

六、ChIP-PCR 技术服务
    康成生物提供ChIP-qPCR服务,能够检测特定转录因子/组蛋白修饰与已知基因启动子区域的结合;在已知启动子范围内寻找特定转录因子/组蛋白修饰的结合位点。

    ChIP-qPCR完美结合了ChIP技术和实时定量PCR技术。ChIP技术利用抗体特异性富集与特定转录因子/组蛋白修饰结合的DNA片段;qPCR技术使用SYBR荧光染料,非特异性的掺入DNA双链,发射荧光,保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步,最后利用Ct值进行定量分析。ChIP-qPCR能够专一,灵敏,快速,高重复地定量生物样品中特定转录因子/组蛋白修饰与已知基因启动子的结合。
 
ChIP-qPCR技术特点:
    · 高特异性,针对感兴趣的基因启动子设计特异性的实时荧光定量PCR引物;
    · 超宽的线性范围,可跨越7个数量级;
    · 精确度高,重复性好;
    · 灵敏度高
 
康成生物ChIP-qPCR技术服务流程:
    A. 样品交联,甲醛处理细胞,交联DNA与DNA结合蛋白
    B. 超声打断染色质,裂解细胞,并以超声波将染色质打断成400-500bp的片段
    C. 染色质免疫共沉淀,将B所得片段分成两份,一份与特异性抗体进行免疫共沉淀(ChIP),另一份作为Total input样品
    D. DNA纯化,将C所得两份蛋白-DNA复合物解交联,纯化分离DNA片段。ChIP富集的DNA片段(ChIP DNA),Total input样品中的DNA片段(Total input DNA)
    E. 实时荧光定量PCR检测

 实验数据处理
  ● Total input DNA样品作为模板,用待测基因特异性引物进行qPCR,检测得到Ct值(Input)
  ● ChIP DNA样品作为模板,用待测基因特异性引物进行qPCR,检测得到Ct值(ChIP)
  ● 待测基因免疫共沉淀的效率(ChIP / Total input)可通过以下公式计算:
    %(ChIP / Total input) = 2^[ Ct (Input)- Ct (ChIP) ] * 100
 
 
 
 
 

 上海康成生物工程有限公司 

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免费热线:400-886-5058 ; 800-820-5058(座机)
电话:021-64451989         传真:021-64452021
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