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piRNA芯片技术服务上海康成生物工程有限公司

技术服务信息

服务名称:piRNA芯片技术服务
服务类别:生物芯片服务 - 生物芯片处理和分析服务
价格:询价
允许参观:不允许参与实验
所在区域:上海.上海
更新时间:2018/11/14 9:52:00
浏览人数:1939
诚信指数:972点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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上海康成生物工程有限公司
地址:
上海市宜山路700号C2栋3楼 (200233)
邮编:
200233
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800-820-5058/ 400-886-5058(免费热线);021-64451989
传真:
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market@kangchen.com.cn
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技术服务详细描述

piRNA芯片技术服务

    piRNA(Piwi-interacting RNA)是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类非编码小RNA,这类小RNA可与Piwi(P-element Induced Wimpy Testis)蛋白家族成员相互作用。Piwi蛋白家族包括在果蝇上表达的Piwi、 Aubergine 和AGO3蛋白,在小鼠上表达的MILI、MIWI 和 MIWI2蛋白,以及在人上表达的HILI、 HIWI1、 HIWI2和HIWI3蛋白[1]。虽然piRNA的生物起源和功能还未完全阐明,越来越多的证据表明piRNA对生殖细胞的发育非常关键。

 
   成熟的piRNA是一类长约26-32nt的单链小RNA分子。在小鼠睾丸内只存在几百种不同的miRNA,而piRNA却至少有5万种[2]。piRNA即使在近缘物种之间保守性也很差,在长度、表达类型和基因结构上则与microRNA截然不同。
 
piRNA的生物起源
    与siRNA和miRNA的产生机制不同,piRNA并不产生于dsRNA前体。它似乎来自成簇piRNA的初始转录物,随后再形成成熟的piRNA,此过程的详细机制目前尚不清楚。然而从果蝇中的研究发现,与Aub或者Piwi相互结合的piRNA的前十个核苷酸(一般首个核苷酸是尿苷),可以和与Ago3结合的piRNA的前十个核苷酸(一般在10位的是腺苷)互补。由此提出了piRNA形成的“乒乓”模型,即由于piRNA之间序列互补,因此互为引物进行扩增,产生新的piRNA[3]。
图1  piRNA生物起源的“乒乓”模型。piRNA之间的序列互补引起piRNA分子的扩增[3]。
 
piRNA的功能
     在精母细胞发育过程中,不同减数分裂期表达的piRNA不同,由此可将哺乳类piRNA分为前粗线期piRNA和粗线期piRNA。根据序列特征的不同,推测它们可能具有不同的功能[1]。
图2  与小鼠体内Piwi蛋白家族成员比如Mili和Miwi相关联的piRNA可以分为具有不同功能的两类[4]。
 
大量的证据表明,piRNA在精子形成中有不可或缺的作用。
   •  精子形成: 在精子形成过程中,Mili和Miwi蛋白的完全缺失会导致减数分裂停滞,造成细精管中无精子产生。
   •  翻译调控:在精子形成所需蛋白的合成过程中,Miwi和piRNA与帽结合复合体联结,调控mRNA的稳定性[5]。
   •  基因组完整性的保存:Mili和Miwi双敲除小鼠体内逆转录转座子活性增加,表明piRNA可以保护精子基因组免受转座子插入的危害[6]。
 
 展望
     距离多个物种piRNA的发现已经过去了八年,但是我们对于新piRNA响应如何起始以及发育过程中piRNA的准确功能仍不清楚,还有许多开放性问题亟须解决。由于piRNA数目庞大,piRNA的鉴定要比miRNA更具挑战性。然而,随着芯片和高通量测序技术的完善,研究人员将能够对piRNA的生物学功能进行全面深入的研究。
 
Arraystar piRNA芯片
    Arraystar的科学家已经研制了针对人、小鼠和大鼠的piRNA芯片,可以对piRNA的总体表达情况进行检测。三个物种的piRNA序列都来自NCBI数据库,并且使用UCSC Blat技术在HG19, MM9 和 RN4数据库中分别进行染色体定位(map)。我们采用恰当的策略来挑选探针,然后使用双重方法(duplex method)设计60 mer的反义寡核苷酸探针。使用我们专有的piRNA芯片(表1),我们将提供从样品准备到全面数据分析的综合服务。
 
芯片名称
物种
数据库
格式
检测的 piRNA
Arraystar Human piRNA Array
Human
HG19
4 * 44K
23,677
Arraystar Mouse piRNA Array
Mouse
MM9
4 * 44K
43,537
Arraystar Rat piRNA Array
Rat
RN4
4 * 44K
39,727
 
康成生物piRNA芯片技术服务实验流程
1. 样品RNA抽提
    a. 实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织,加1ml的RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen),使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。
    b. 实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,加1ml的RNA抽提试剂TRIzol(样品为贴壁细胞,每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml),裂解后抽提RNA。
2. RNA 质量检测
    a. 使用Nanodrop测定RNA 在分光光度计260nm 、280nm和230nm的吸收值,以计算浓度并评估纯度。
    b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA 纯度及完整性。
    c. 提供RNA QC报告。
        注意:用于芯片检测的RNA样品,必须是高质量的,完整的,没有RNase污染(降解的样品不能用于标记和芯片检测),没有基因组污染。
3. 制备荧光标记探针
    使用Arraystar标记试剂盒荧光标记piRNA
4. 芯片杂交
    在标准条件下使用杂交仪将标记好的探针和Arraystar piRNA芯片杂交。
5. 图像采集和数据分析
    使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数字型数据保存,使用配套软件对原始数据进行分析运算。
6. 提供实验报告—— 包括详细的实验方法和芯片实验数据及图表
   a. 芯片扫描图
   b. 操作说明(含RNA质检报告)
   c. 芯片数据
   数据汇总表格(EXCEL格式,包含探针位置,探针名称,原始信号值,修正信号值,标准化信号 值,样品间piRNA表达量的比值)
   差异表达piRNA的数据表格(EXCEL格式,包含表达上调2倍的piRNA和表达下调2倍的piRNA)
   d. 进一步数据分析
   Scatter Plot(主要针对单色重复实验数据进行相关性R值计算)
   分层聚类(进行多个样品实验时,按基因表达相似程度进行聚类,从而将多个样品进行归类)
若进行重复实验(≥3)则计算CV值、p值,并做Volcano Plot
 
 
 
 
 

上海康成生物工程有限公司 
地址:上海市漕河泾高新技术开发区虹漕路42163号楼2 
免费热线:400-886-5058 ; 800-820-5058(座机)
电话:021-64451989         传真:021-64452021
网址:www.kangchen.com.cn

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