piRNA芯片技术服务
产品名称： piRNA芯片技术服务
英文名称： piRNA Array Service
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上海康成生物工程有限公司
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piRNA芯片技术服务
piRNA（Piwi-interacting RNA）是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类非编码小RNA，这类小RNA可与Piwi（P-element Induced Wimpy Testis）蛋白家族成员相互作用。Piwi蛋白家族包括在果蝇上表达的Piwi、 Aubergine 和AGO3蛋白，在小鼠上表达的MILI、MIWI 和 MIWI2蛋白，以及在人上表达的HILI、 HIWI1、 HIWI2和HIWI3蛋白[1]。虽然piRNA的生物起源和功能还未完全阐明，越来越多的证据表明piRNA对生殖细胞的发育非常关键。
成熟的piRNA是一类长约26-32nt的单链小RNA分子。在小鼠睾丸内只存在几百种不同的miRNA，而piRNA却至少有5万种[2]。piRNA即使在近缘物种之间保守性也很差，在长度、表达类型和基因结构上则与microRNA截然不同。
piRNA的生物起源
与siRNA和miRNA的产生机制不同，piRNA并不产生于dsRNA前体。它似乎来自成簇piRNA的初始转录物，随后再形成成熟的piRNA，此过程的详细机制目前尚不清楚。然而从果蝇中的研究发现，与Aub或者Piwi相互结合的piRNA的前十个核苷酸（一般首个核苷酸是尿苷），可以和与Ago3结合的piRNA的前十个核苷酸（一般在10位的是腺苷）互补。由此提出了piRNA形成的“乒乓”模型，即由于piRNA之间序列互补，因此互为引物进行扩增，产生新的piRNA[3]。
图1 piRNA生物起源的“乒乓”模型。piRNA之间的序列互补引起piRNA分子的扩增[3]。
piRNA的功能
在精母细胞发育过程中，不同减数分裂期表达的piRNA不同，由此可将哺乳类piRNA分为前粗线期piRNA和粗线期piRNA。根据序列特征的不同，推测它们可能具有不同的功能[1]。
图2 与小鼠体内Piwi蛋白家族成员比如Mili和Miwi相关联的piRNA可以分为具有不同功能的两类[4]。
大量的证据表明，piRNA在精子形成中有不可或缺的作用。
• 精子形成： 在精子形成过程中，Mili和Miwi蛋白的完全缺失会导致减数分裂停滞，造成细精管中无精子产生。
• 翻译调控：在精子形成所需蛋白的合成过程中，Miwi和piRNA与帽结合复合体联结，调控mRNA的稳定性[5]。
• 基因组完整性的保存：Mili和Miwi双敲除小鼠体内逆转录转座子活性增加，表明piRNA可以保护精子基因组免受转座子插入的危害[6]。
展望
距离多个物种piRNA的发现已经过去了八年，但是我们对于新piRNA响应如何起始以及发育过程中piRNA的准确功能仍不清楚，还有许多开放性问题亟须解决。由于piRNA数目庞大，piRNA的鉴定要比miRNA更具挑战性。然而，随着芯片和高通量测序技术的完善，研究人员将能够对piRNA的生物学功能进行全面深入的研究。
Arraystar piRNA芯片
Arraystar的科学家已经研制了针对人、小鼠和大鼠的piRNA芯片，可以对piRNA的总体表达情况进行检测。三个物种的piRNA序列都来自NCBI数据库，并且使用UCSC Blat技术在HG19, MM9 和 RN4数据库中分别进行染色体定位（map）。我们采用恰当的策略来挑选探针，然后使用双重方法（duplex method）设计60 mer的反义寡核苷酸探针。使用我们专有的piRNA芯片（表1），我们将提供从样品准备到全面数据分析的综合服务。
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芯片名称
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物种
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数据库
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格式
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检测的 piRNA数
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Arraystar Human piRNA Array
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Human
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HG19
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4 * 44K
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23,677
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Arraystar Mouse piRNA Array
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Mouse
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MM9
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4 * 44K
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43,537
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Arraystar Rat piRNA Array
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Rat
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RN4
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4 * 44K
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39,727
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康成生物piRNA芯片技术服务实验流程
1. 样品RNA抽提
a. 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。
b. 实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA。
2. RNA 质量检测
a. 使用Nanodrop测定RNA 在分光光度计260nm 、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA 纯度及完整性。
c. 提供RNA QC报告。
注意：用于芯片检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase污染（降解的样品不能用于标记和芯片检测），没有基因组污染。
3. 制备荧光标记探针
使用Arraystar标记试剂盒荧光标记piRNA
4. 芯片杂交
在标准条件下使用杂交仪将标记好的探针和Arraystar piRNA芯片杂交。
5. 图像采集和数据分析
使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
6. 提供实验报告—— 包括详细的实验方法和芯片实验数据及图表
a. 芯片扫描图
b. 操作说明（含RNA质检报告）
c. 芯片数据
数据汇总表格（EXCEL格式，包含探针位置，探针名称，原始信号值，修正信号值，标准化信号 值，样品间piRNA表达量的比值）
差异表达piRNA的数据表格（EXCEL格式，包含表达上调2倍的piRNA和表达下调2倍的piRNA）
d. 进一步数据分析
Scatter Plot（主要针对单色重复实验数据进行相关性R值计算）
分层聚类（进行多个样品实验时，按基因表达相似程度进行聚类，从而将多个样品进行归类）
若进行重复实验（≥3）则计算CV值、p值，并做Volcano Plot
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