Illumina RNA-Seq表达谱分析北京博奥晶典生物技术有限公司

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技术服务信息

服务名称:Illumina RNA-Seq表达谱分析
服务类别:生物芯片服务 - 生物芯片制备服务
价格:询价
允许参观:不允许参与实验
所在区域:北京.北京
更新时间:2018/5/8 18:49:00
浏览人数:10485
诚信指数:1672点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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北京博奥晶典生物技术有限公司
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技术服务详细描述

Illumina RNA-Seq表达谱分析

简介

  基因表达谱测序为对组织或细胞在特定状态下产生的mRNA进行高通量测序分析得到基因差异表达的情况。测序法进行基因表达分析具有定量准确,重复性、特异性、灵敏性高的特点。与全转录组测序研究相比,表达谱测序采用单端短读长的策略,测序通量较小,成本较低;与芯片法相比,测序法具有无需样本序列信息即可实现任一物种已知和未知转录本差异研究的开放性特点,对低丰度转录本的检测具有灵敏性和特异性高的优点。博奥生物具有近10年的表达谱服务经验,实验室通过标准化认证并具备严格的质量控制管理系统,同时拥有多种芯片平台、高通量测序平台、验证平台、高性能计算平台及专业的实验技术和生物信息团队,可为客户提供高质量的服务。客户可根据实验目的,灵活选择合适的测序深度,以达到对不同丰度转录本的检测要求。一般5-10M reads数的测序量即可检测到比芯片更多的差异基因。如果对低丰度表达基因的关注度高,建议至少测30M以上的reads。

实验流程

1.样品提取总RNA后,过柱纯化,保留200nt以上的RNA。

2.富集mRNA,并用二价阳离子高温加热的方法将mRNA片断化。

3.以mRNA短片段为模板,用六碱基随机引物反转录合成双链cDNA。


4.经纯化、末端修复、加碱基A、加测序接头的步骤,根据测序长度和是否做对读测序,确定琼脂糖凝胶电泳回收片段的大小,并进行PCR扩增,完成测序文库的制备。


5.构建好的文库经cBot扩增,用IlluminaGAIIx进行单端或对读测序。

技术优势

精确性高:精确到单核苷酸水平,可区分高度同源的RNA分子,鉴定剪切变异体和RNA多态性。

高度开放性:无需预先了解序列信息,可研究任一物种已知和未知的转录本序列及定量信息。

灵敏度高:可检测低丰度转录本。

检测范围广:可在超过6个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析。

灵活性高:可根据实验目的灵活选择合适的测序reads深度和reads读长,以达到对不同丰度转录本及序列变异的检测要求。

样品要求

样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。

样品量:细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300mg的组织块或切片,RNA样品请提供30 μg以上的总RNA。

样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μl,28S:18S≥1.5,RIN≥8。

样品保存:细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后,-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

样品运输:样品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输。

数据分析

1.去除低质量、污染、接头的序列(reads)统计,包括reads长度、reads数量、reads碱基偏好、数据产量等统计分析

2.数据饱和度分析

3.表达丰度分布统计

4.重复性分析(需有2次以上独立的重复实验数据)

5.样本间共有、特有及差异标签统计

6.标签序列注释

7.基因表达图谱分析

8.基因表达模式聚类分析

9.基因差异表达分析

10.Gene Ontology显著性富集分析

11.Pathway显著性富集分析

参考文献

1.Mortazavi A, Williams B, McCue K, Schaeffer L, Wold B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods, 2008; 5: 621-628.

2.Maher CA, Kumar-Sinha C, Cao X, et al. Transcriptome Sequencing to Detect Gene Fusions in Cancer.Nature, 2009; 458: 97-101.

3.Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet, 2009; 10: 57-63.

4.Zhang G, Guo G, Hu X, et al. Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome. Genome Res, 2010; 20: 646-654.

5.Cirulli ET, Singh A, Shianna1 KV.Screening the human exome: a comparison of whole genome and whole transcriptome sequencing. Genome Biol,2010;11:R57.

6.Palanisamy N, Ateeq B, Kalyana-Sundaram S, et al. Rearrangements of the RAF kinase pathway in prostate cancer, gastric cancer and melanoma. Nature Med, 2010; 16:793-798.

7.Illumina white paper for sequencing: RNA-Seq data comparison with gene expression microarrays.

 

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