人Oct-4过表达载体构建

摘要：和元生物以cDNA为模板，扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究，而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达Oct-4基因。

关键词：Oct-4，过表达, EGFP-3FLAG， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理
和元PCR扩增Oct-4基因序列，构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体CMV-EGFP序列间的EcoR I多克隆位点，目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表达。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下：

二、 实验目的
和元构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的Oct-4基因过表达慢病毒载体.

三、 实验方法
和元PCR扩增的Oct-4基因序列与经由EcoR I酶切后的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下：
1. 引物设计：
和元从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI软件进行引物设计。PCR扩增目的基因：
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：
 

 
2. 琼脂糖凝电泳检测PCR扩增结果：
和元目的基因PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝电泳检测①，通过和DNA Maker的对比，判断目的基因是否扩增成功。
3. 胶回收目的基因片段：
和元把目的基因条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备：
和元用限制性内切酶对表达载体的进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中：


6. 感受态细胞的制备和转化：
和元DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》②
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
和元挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

 

8. 阳性克隆送测序：
和元菌落鉴定得到的阳性克隆，送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提：
和元测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、和元实验结果
1. PCR扩增目的基因：
和元用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT（含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC（引物说明：含同源重组序列、EcoR I酶切位点，并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因）对人cDNA进行扩增，预期PCR产物大小为1126 bp，电泳结果如下：

DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

2. 表达载体的线性化
和元用EcoR I对表达载体进行双酶切，胶回收4801bp的载体片段，酶切图谱如下：

 

                                                              
1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
和元用菌落PCR鉴定转化子，正向引物CMV-F   CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV启动子序列中，反向引物pEGFP-N-3   CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列，阳性克隆得到1287bp的片段，空载体对照得到252bp的片断。电泳结果如下：
                                                              

1. 阴性对照（H2O）
2. 阴性对照（空载体）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp  4~11   挑取的8个转化子接种阳性克隆，保种并分装100μL送测序。经验证序列无误的，抽提质粒。
4. 和元测序结果分析
阳性克隆测序结果表明，和预期序列完全一致。

五、和元参考文献

1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社，P57~58

2. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社，P25~26