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DNA甲基化测序服务上海康成生物工程有限公司

技术服务信息

服务名称:DNA甲基化测序服务
服务类别:分子生物学服务 - 第二代高通量测序
价格:询价
允许参观:不允许参与实验
所在区域:上海.上海
更新时间:2018/11/14 9:52:00
浏览人数:7401
诚信指数:972点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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供应商联系卡

上海康成生物工程有限公司
地址:
上海市宜山路700号C2栋3楼 (200233)
邮编:
200233
电话:
800-820-5058/ 400-886-5058(免费热线);021-64451989
传真:
021-64452021
联系人:
market@kangchen.com.cn
所在区域:
上海·上海
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技术服务详细描述

       DNA甲基化是表观遗传(Epigenetics)调控的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要的作用,是目前新的研究热点之一。在哺乳动物中,甲基化一般发生在CpG的胞嘧***5位碳原子上,通过使用5’-甲基胞嘧***抗体富集高甲基化的DNA片段,并结合Illumina高通量测序平台,对所有富集的DNA片段进行高通量测序,研究人员能够获得全基因组范围内高精度的甲基化状态,为深入的表观遗传调控分析提供了更有利的切入点。

 

康成生物为您提供甲基化测序技术服务,您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,康成的技术服务人员就可为您完成全部实验操作,包括超声打断基因组、甲基化DNA免疫共沉淀、MeDIP与 Input DNA文库构建、高通量测序和数据分析、并提供完整的实验报告。

 
DNA甲基化测序技术优势
* 灵活度高:能够直接对任意物种的高甲基化片段进行测序,无需已知的基因组序列信息。
* 检测范围广:覆盖整个基因组范围的甲基化区域。
* 精确度高:能够在实际结合位点50个碱基范围内精确定位。
* 数字化信号:直接对甲基化片段进行测序和定量,不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

康成MeDIP-seq技术服务优势
*MeDIP富集效果特异性佳:MeDIP是获得准确测序数据的关键。康成MeDIP平台经过不断地优化,抗体富集效率高和特异性好
*图释:康成优化后的MeDIP平台效果。横坐标为MeDIP-score其数值大小代表基因启动子甲基化水平,纵坐标为基因的数目。左图为用经典MeDIP方法构建测序文库的效果,阳性基因H19和Xist的信号无法和阴性基因GAPDH进行区分。右图为优化后的结果展示,阳性基因的MeDIP-score值远高于阴性基因,证明抗体富集的特异性。


严格的质控体系:康成生物在MeDIP-seq每个关键步骤都加入了质控实验。这些QC数据能够评估每个步骤的质量。如果达不到标准,我们会重复实验步骤或者优化实验体系,使得每个样品都能够顺利进入下个实验环节。

 

*图释: MeDIP-qPCR 质控。测序实验之前先对MeDIP实验效果进行评估,确定抗体富集的特异性。图中H19的启动子区域为阳性对照,管家基因GAPDH启动子区域为阴性对照,检测结果以MeDIP样品和Input样品的qPCR数据的比值表示。可以看出:MeDIP特异地富集甲基化的DNA区域,且阳性信号远高于背景噪音。

*图释: MeDIP-seq技术服务流程和关键步骤的质量控制

优化的文库制备流程: 起始量少至1μg乃至更少量的起始DNA样品即可进行甲基化测序实验;同时,对MeDIP富集过程及测序文库严格的质量***保证了高品质的测序结果。

对DNA甲基化水平进行数字化定量分析:通过对测序得到的大量序列进行深入分析,MeDIP-seq得到的序列信息能够转换为可定量的甲基化水平信息。对基因组任意区域的甲基化水平给出定量的结果,并分析差异甲基化的区域。

可视化分析: 提供50bp精度的全基因组DNA甲基化信号可视化数据。通过UCSC基因组浏览器(UCSC genome browser),任意区域的甲基化水平能够直观的进行展示和比较。
 
康成基本数据分析结果展示
● 全基因组羟甲基化谱
1. 甲基化峰识别:通过MACS软件,可以利用与基因组匹配的read来识别甲基化峰,常用的MACS筛选参数:FDR<0.01。

上表: 全基因组甲基化谱数据列表
2.  甲基化峰注释:利用最新的RefSeq数据库,通过每个峰通过与其最邻近基因位置关系对羟甲基化峰进行注释,分成:启动子峰,外显子峰,内含子峰,非翻译区峰,基因间羟甲基化峰。
上图: 利用全基因组甲基化谱数据作出的不同样品间的羟甲基化峰分布图。

3.  启动子区的羟甲基化谱: 已有的研究表明基因启动子区域的DNA羟甲基化在基因表达调控中发挥着重要的作用,为了方便客户的研究。康成生物专门将基因启动子区域的羟甲基化峰挑出来,并对它与邻近基因的关系以及邻近基因的功能进行了详细的注释。

差异羟甲基化区域
1.  识别差异甲基化基因:通过MACS软件,康成生物对不同样品或样品组间的基因启动子区域的差异羟甲基化进行了分析。为了对羟甲基化水平进行定量分析,处理组和对照组的样品分别通过相应的input样品进行标准化。根据处理组样品羟甲基化水平相对对照组的上下调情况,这些在启动子区域差异羟甲基化的基因被分成了“重新甲基化”(de novo methylation)和“去甲基化”(de-methylation)基因。

* 差异甲基化基因列表
 
2.  差异羟甲基化基因的聚类分析   
     聚类分析对于理解差异羟甲基化基因的功能、调控是十分有帮助的。具有相似羟甲基化模式的样品能够被聚类在一起,以揭示难以用传统方法鉴定的潜在信息。

 *图释:DMR区域聚类分析应用实例。AML病人按照血清中2-羟基戊二酸的含量分成2-HG高和2-HG正常两组。分离病人早期造血干细胞,检测DNA甲基化图谱,筛选组间差异甲基化的基因进行聚类分析。聚类结果表明两类病人呈现不同的甲基化特征。
 
3.  差异羟甲基化基因的GO分析
     为了方便客户了解启动子差异羟甲基化基因的功能,康成生物还分别提供了去羟甲基化基因和超羟甲基化基因的GO分析。
 
4.  差异羟甲基化基因的Pathway分析
     为了方便客户了解启动子差异羟甲基化基因参与的生物学过程,康成生物还分别提供了去羟甲基化基因和超羟甲基化基因的Pathway分析。



·可视化
  
  康成生物提供WIG 格式的hMeDIP-Seq羟甲基化谱数据,可以通过UCSC浏览器或IGB浏览器进行可视化。通过可视化话图,客户可以直观的了解具体区域或基因的羟甲基化情况,已经样品间的差异羟甲基化状况。


康成生物提供的DNA甲基化测序服务流程
1. 甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP
2. 测序文库构建
3. DNA成簇(Cluster)扩增
4. 高通量测序
5. 数据分析
6. 提供实验报告



案例分析——DNA甲基化测序(MeDIP-Seq)
癌症早期诊断分子标记物筛选(DNA–Methylome Analysis of Mouse Intestinal Adenoma Identifies a Tumour-Specific Signature That Is Partly Conserved in Human Colon Cancer. Plos Genet. 2013)

      小鼠模型可以模拟癌症发生的最初状态,找到疾病早期发生的表观遗传变化,这些变化位点可以作为肠腺癌早期诊断的分子标志物。研究者用MeDIP-seq检测疾病小鼠模型(APC基因缺失)的正常组织(n=3),腺癌组织(n=3)以及正常小鼠的小肠组织(n=3)样品。测序量为每个样品20 M reads, 平台为illumina。 比对腺癌组织和正常组织的数据,筛选得到13,000个差异甲基化区域(DMR)。

      针对MeDIP-seq的数据进行生物信息分析,发现小鼠癌组织中DNA甲基化水平升高的基因显著地富集在PRC2靶标基因中,因此推测在癌组织中PRC2引起的组蛋白H3K27me3修饰变化和DNA甲基化之间存在互作关系。进一步通过表达谱的数据发现,DNMT3b,EZH2等表观修饰酶在癌组织中表达量发生改变,说明了小鼠腺癌组织发生表观遗传修饰改变的分子机制。

      同时,研究者用MeDIP-seq方法对14对人结肠癌和癌旁组织行检测。综合两部分数据,找到54个保守基因在人和小鼠癌组织中呈现相同的DNA甲基化变化模式(图4),这些基因启动子的变化是在临床样本中的表现非常均一,是结肠癌中的核心表观遗传改变,可以作为早期诊断的候选标志物。

技术路线:


结果展示:
     
对小鼠组织的MeDIP-seq数据进行分析,发现腺癌组织和正常小肠相比有13000个区域发生甲基化水平的变化(DMR)


           图1. A. 根据DMR在基因组的位置,分类进行统计分析。发现差异的甲基化区域主要集中CpG岛以及包含CpG的启动子区域CGI: CpGProm: 基因启动子Exon:外显子; Exon/Prom: 外显子和启动子交界处; Repeat:重复序列; Intron: 内含子
          B. UCSC browser可视化文件查看Ush1g基因的DMR,该区域在腺癌Ad4, Ad4-1, Ad5, Ad6, Ad7与正常小肠(B1, B2, B3)癌旁组织(N4,N5,N6)相比DNA甲基化水平升高


     图2.GSEA分析:证明腺癌中甲基化水平升高的基因(hypermethylated promoter)显著富集在PRC2的靶标基因中,p<0.001, FDR=0。

     小鼠腺癌和正常组织相比表达水平的差异基因和DNA甲基化水平的差异基因的联合分析,用韦恩图表示,如图3。

       图3. A:启动子区域DNA甲基化水平变化的基因;启动子DNA甲基化水平降低的基因有25个表达上调,5个表达下调;启动子DNA甲基化水平升高的基因中有14个表达下调,8个表达上调。
       B: Gene body的DNA甲基化水平发生变化的基因;Gene body DNA甲基化水平降低的基因中有21个表达上调,3个表达下调;Gene body DNA甲基化水平升高的基因中有11个表达下调,9个表达上调。

     早期癌症小鼠模型的MeDIP-seq数据和14例临床样品的MeDIP-seq数据进行联合分析。54个保守基因在临床样本和小鼠模型中甲基化水平变化趋势相同。聚类分析表明这些基因的甲基化水平能够区分癌组织和正常组织,因此可以作为结肠癌早期诊断的标志物的候选分子。(图4)

                         
                                                         图4.聚类分析

 

 

 

上海康成生物工程有限公司 
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