细胞凋亡实验步骤武汉博士德生物工程有限公司

技术服务信息

服务名称:细胞凋亡实验步骤
服务类别:分子生物学服务 - 生物信息学服务
价格:询价
允许参观:不允许参观
所在区域:湖北.武汉
更新时间:2015/8/10 13:43:00
浏览人数:12567
诚信指数:469点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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技术服务详细描述

细胞凋亡检测试剂盒

               In Situ Cell Apoptosis Detection Kit IPOD

产品编号:MK1020

 

保存期:十二个月。-20℃冷冻保存。

 

工作原理

在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase )可以将地高辛标记的dUTP  (DIG-dUTP)标记至3’-OH末端,DIG-dUTP结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶(SABC),然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细包核呈黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。

 

试剂盒内容

1.         标记缓冲液(Labeling Buffer)             1ml

2.         末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)      20μι

3.         DIG-dUTP  (×20)                     20μι

4.         封闭液(Blocking Reagent)                4ml

5.         生物素化抗地高辛抗体(× 100)         20μι

6.         SABC  (× 100)                      20μι

7.         Proteinase K (×200)                   50μι

8. 抗体稀释液                           4ml

阳性对照片2张

用户自备试剂

1.         多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。

2.         0.01M TBS,PH7.5(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯

    乙酸。)

3.         DAB显色试剂盒(博士德公司有售),也可自配显色剂。

 

操作步骤

1.         样品处理

(1)       玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。

(2)      细胞涂片和冰冻切片:最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛【用0.01M PBS(PH7.0---7.6)稀释的多聚甲醛】室温下固定30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。

(3)      组织:有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。

2.         新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2分钟×3次。

3.         标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10—60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。

4.  标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT

和DIG-d-UTP各1μι,加入18μι标记缓冲液中,混匀。甩去切片上多余液体后加

标记液,20μι/片。置样品于湿盒中,37℃标记2小时。

5.       0.01M TBS洗2分钟×3次。

6.        加封闭液50μι/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗。

7.       抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体:(取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μι),混匀后50μι/片加至标本片上。置样品于湿盒中,37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。

8.       抗体稀释液1:100稀释SABC取1ml抗体稀释液加SABC 10μι,混匀后50μι/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。

9.       DAB显色:取1ml蒸馏水,分别加入DAB试剂盒中A,B,C试剂各一滴,混匀后  

    加至标本片上,显色10-30分钟左右。水洗。

10.   苏木素轻度复染。0.01M TBS洗,蒸馏水洗。脱水,透明,封片。显微镜观察。

 

结果判定

细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡的细胞。

 

注意事项

1.       试剂盒严格-20℃存放。

2.初用时如试管底部无可见的试剂,在离心机离心5分钟,使试剂沉至管底。

3.检测过程中切勿使样品干涸。

 

 

 

武汉博士德生物工程有限公司

(武汉市关山二路特1号 国际企业中心3号楼5楼)

430074   027-67845390,1,2,3,5  8008808748 

传真:027-67845396

 

 

 

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