在RNA水平，核酸编辑可以修复疾病相关的序列产生功能性蛋白质，这有望治疗遗传疾病。VI型CRISPR-Cas系统包含可编程的单效应RNA引导的RNase Cas13。在这里，研究者对VI型系统进行了分析，以设计出一种能够稳健敲除的Cas13直系同源物，并通过使用催化失活的Cas13将腺苷转为肌苷脱氨酶活性通过ADAR2引导至哺乳动物细胞中的转录物来证明RNA编辑。该系统被称为可编程A到I替换的RNA编辑（REPAIR），没有严格的序列限制，可用于编辑包含致病性突变的全长转录本。研究者进一步设计该系统，以创建高特异性变体REPAIRv2，该变体的特异性是REPAIRv1的919倍，并最小化该系统以减轻病毒传播。REPAIR为研究、治疗和生物技术提供了一个前景广阔的RNA编辑平台。
图源网络
综述
精确的核酸编辑技术对于研究细胞功能和作为新的治疗方法是有价值的。当前的编辑工具基于可编程核酸酶，如原核簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）相关核酸酶Cas9（1-4）或Cpf1（5），这反过来通过非同源末端连接（NHEJ）或通过模板依赖同源定向修复（HDR）的精确基因编辑来驱动靶向基因断裂（6）。NHEJ利用在分裂细胞和有丝分裂后细胞中都活跃的宿主机制，并通过产生插入或缺失（indel）突变的混合物来提供有效的基因破坏。相比之下，HDR是由宿主机制介导的，其表达主要局限于复制细胞。因此，开发有丝分裂后细胞的基因编辑能力仍然是一个主要挑战。由Cas9尼克酶和胞苷脱氨酶之间的融合组成的DNA碱基编辑器可以在靶窗内介导有效的胞苷到尿苷的转化，并显著减少双链断裂诱导的indels的形成（7，8）。然而，DNA碱基编辑的潜在靶向位点受限于Cas9对编辑位点原间隔物相邻基序（PAM）的要求（9）。在此，研究者描述了使用VI型CRISPR相关RNA引导的RNA酶Cas13（10-13）开发精确灵活的RNA碱基编辑技术。
Cas13酶具有两个高级真核生物和原核生物核苷酸结合（HEPN）内切酶结构域，它们介导精确的RNA切割，优先选择在生物化学和细菌中观察到的具有原间隔物侧翼位点（PFS）基序的靶（10，11）。迄今已鉴定出三个Cas13蛋白家族：Cas13a（以前称为C2c2）、Cas13b和Cas13c（12，13）。研究者最近报道，Cas13a酶可以用作核酸检测（14）以及哺乳动物和植物细胞RNA敲除和转录物追踪（15）的工具。有趣的是，RNA干扰Cas13a不需要生物化学PFS（15）。Cas13酶的可编程性质使其成为开发RNA结合和干扰应用工具的一个有吸引力的起点。
作用于RNA（ADAR）家族酶的腺苷脱氨酶通过腺苷水解脱氨化为肌苷（一种在翻译和剪接功能上等同于鸟苷的核碱）介导转录物的内源性编辑（16，17）。有两个功能性的人ADAR同源基因ADAR1和ADAR2，它们由N端双链RNA结合结构域和C端催化脱氨基结构域组成。ADAR1和ADAR2的内源性靶位点包含大量的双链同一性，催化结构域需要双链区域，以便在体外和体内进行有效编辑（18，19）。重要的是，ADAR催化结构域能够在体外无任何蛋白质辅因子的情况下脱氨靶腺苷（20）。已发现ADAR1主要针对重复区域，而ADAR2主要针对非重复编码区域（17）。尽管ADAR蛋白具有可限制靶向潜在灵活性的优选编辑基序，但超活性突变体，如ADAR2（E488Q）（21），可以放松序列限制，提高腺苷对肌苷的编辑率。ADAR优先对RNA双链体中与胞苷碱基错配的腺苷脱氨化（22），为精确的碱基编辑提供了一个有希望的机会。尽管先前的方法已经通过RNA导向器设计了靶向ADAR融合（23-26），但尚未报道这些方法的特异性，它们各自的靶向机制依赖于RNA-RNA杂交，而无需蛋白伴侣的帮助，这可能会增强靶向识别和严格性。
在这里，研究者测定了哺乳动物细胞中RNA敲除活性的Cas13酶家族的一个子集，并鉴定了Prevotella sp.P5-125（PspCas13b）的Cas13b同源物是哺乳动物细胞应用中最有效和最特异的。然后，研究者将ADAR2脱氨酶结构域（ADAR2DD）与催化失活的PspCas13b融合，并证明RNA编辑可编程A到I（G）替换（REPAIR）报告和内源性转录物以及与疾病相关的突变。最后，研究者采用了一种合理的诱变方案来提高dCas13b-ADAR2DD融合的特异性，以产生具有919倍以上特异性的REPAIRv2。
结果
哺乳动物细胞中Cas13家族成员
研究者之前开发了用于哺乳动物敲除应用的LwaCas13a，但它需要单体超折叠GFP（msfGFP）稳定结构域来有效敲除，尽管特异性很高，但敲除水平并不始终低于50%（15）。研究者试图通过表征一组具有遗传多样性的Cas13家族成员，以评估其在哺乳动物细胞中的RNA敲除活性，来鉴定一种更稳健的RNA靶向CRISPR系统（图1A）。研究者生成了多种Cas13蛋白的哺乳动物密码子优化版本，包括21个Cas13a的同源基因、15个Cas13b的同源基因和7个Cas13c的同源基因，并将它们克隆到具有N端和C端核输出信号（NES）序列和C端msfGFP的表达载体中，以增强蛋白稳定性（补充表1）。为了测定哺乳动物细胞中的干扰，研究者设计了一种双报告构建体，在单独的启动子下表达独立的Gaussia（Gluc）和Cypridinia（Cluc）荧光素酶，这允许一种荧光素酶作为Cas13干扰活性的测量，另一种作为内部对照。对于每个Cas13同源物，研究者使用氨苄青霉素干扰试验（图S1；补充表2；补充信息）得出的Cas13b PFS基序和先前Cas13a活性报告中的3'H（非G）PFS设计了原间隔物侧翼位点（PFS）兼容的导向RNA（10）。
研究者用Cas13表达、引导RNA和报告质粒转染HEK293FT细胞，然后在48小时后量化Cas13表达水平和靶向Gluc（图1B，图S2A）。测试每个Cas13同源物的两个引导RNA揭示了一系列活性水平，包括五个Cas13b同源物，相对于最近表征的LwaCas13a，两个引导RNAs的干扰相似或增加（图1B），研究者观察到Cas13表达和干扰活性之间只有微弱的相关性（图S2B–D）。研究者选择了排名前五的Cas13b正交测井仪，以及排名前两的Cas13a正交测井仪进行进一步的工程设计。
接下来，研究者测试了不含msfGFP的Cas13介导的Gluc的敲除，以选择不需要稳定结构域的同源物来实现稳健的活性。研究者假设Cas13活性可能受到亚细胞定位的影响，正如研究者先前报道的LwaCas13a的优化（15）。因此，研究者测试了七个选择的Cas13同源物C端融合到六个不同定位标签之一的干扰活性，而不含msfGFP。使用荧光素酶报告物分析，研究者确定了干扰活性最高的前三个Cas13b设计：来自Prevotella sp.P5-125（PspCas13b）的Cas13b和来自与HIV Rev基因NES融合的古斑紫菜（PguCas13b）C端的Cas13a和来自鸭疫里氏杆菌（RanCas13b，C端与MAPK NES融合（图S3A）。为了进一步区分顶部同源物的活性水平，研究者将三种优化的Cas13b构建体与优化的LwaCas13a-msfGFP融合体以及shRNA进行了比较，以了解它们使用位置匹配指南敲低内源性KRAS转录物的能力（图S3B）。研究者观察到PspCas13b的最高水平干扰（平均敲除率为62.9%），因此选择该干扰与LwaCas13a进行进一步比较。
为了更严格地定义PspCas13b和LwaCas13a的活性，研究者设计了沿着Gluc和Cluc转录物的位置匹配指南，并使用研究者的荧光素酶报告物测定法测定了它们的活性。研究者分别测试了93个和20个针对Gluc和Cluc的位置匹配指南，并发现PspCas13b相对于LwaCas13a的敲除水平持续增加（PspCas13 b的平均敲除率为92.3%，而LwaCas13a的平均敲减率为40.1%）（图1C，D）。
Cas13的干扰特异性
为了表征PspCas13b和LwaCas13a的干扰特异性，研究者设计了一个荧光素酶靶的质粒库，其包含整个靶序列和三个侧翼5’和3’碱基对的单错配和双错配（图S3C）。研究者用LwaCas13a或PspCas13b转染HEK293FT细胞，这是一种靶向未修饰靶序列的固定导向RNA，以及与适当系统相对应的错配靶文库。然后，研究者对未分离的转录物进行靶向RNA测序，以量化失配靶序列的缺失。研究者发现，LwaCas13a和PspCas13b的中心区域对单个失配相对不耐受，从PspCas13 b靶的12–26碱基对延伸到LwaCas13 a靶的13–24碱基对（图S3D）。与单突变相比，双失配的耐受性甚至更低，在更大的窗口内几乎没有观察到敲除活性，从PspCas13b的12–29碱基对和LwaCas13a的8–27碱基对延伸到它们各自的靶点（图S3E）。此外，由于靶序列5'和3'端侧翼的三个核苷酸存在失配，研究者可以评估PFS对Cas13敲除活性的限制。测序表明，几乎所有的PFS组合都允许稳健的敲除，这表明无论是哪种酶，哺乳动物细胞中的干扰都可能不存在PFS限制。这些结果表明，Cas13a和Cas13b显示出相似的序列约束和对失配的敏感性。
研究者接下来描述了PspCas13b和LwaCas13a在转录组mRNA部分的干扰特异性。研究者进行了转录组范围的mRNA测序，以检测显著的差异表达基因。LwaCas13a和PspCas13b显示了Gluc的强大敲除（图1E，F），并且与位置匹配的shRNA相比具有高度特异性，shRNA显示了数百个非靶点（图1G），这与研究者先前对哺乳动物细胞中LwaCas13 a特异性的描述一致（15）。
Cas13-ADAR靶向RNA编辑
鉴于PspCas13b在哺乳动物细胞中实现了一致、稳健和特异性的mRNA敲除，研究者设想它可以作为RNA结合平台来招募RNA修饰结构域，如ADAR的脱氨酶结构域（ADARDD），用于可编程RNA编辑。为了设计缺乏核酸酶活性的PspCas13b（dPspCas13b，以下称为dCas13b），研究者突变了HEPN结构域中的保守催化残基，并观察到荧光素酶RNA敲除的损失（图S4A）。研究者假设dCas13b-ADARDD融合体可以被引导RNA招募到靶向腺苷，杂交RNA产生ADAR活性所需的双链底物（图2A）。为了提高靶腺苷脱氨率，研究者对最初的RNA编辑设计进行了两项额外的修改：研究者引入了与靶腺苷相对的错配胞苷，此前有报道称其可增加脱氨频率，并将dCas13b与含有超活化突变的人ADAR1或ADAR2的脱氨酶结构域融合以增强催化活性（ADAR1DD（E1008Q）（27）或ADAR2DD（E488Q）（21））。
为了测试dCas13b ADARDD的活性，研究者通过引入无义突变（W85X（UGG->UAG））在Cluc上生成了一个RNA编辑报告子，该突变可以通过a->I编辑在功能上修复为野生型密码子（图2B），然后作为Cluc发光的恢复进行检测。研究者在靶腺苷上用长度为30、50、70或84个核苷酸的间隔物均匀平铺引导物，以确定最佳引导物放置和设计（图2C）。研究者发现，dCas13b-ADAR1DD需要更长的导管来修复Cluc报告器，而dCas13b-ADAR2DD在所有导管长度测试时都能正常工作（图2C）。研究者还发现，由于野生型ADAR2DD的荧光素酶修复减少，过度活跃的E488Q突变提高了编辑效率（图S4B）。从这一活性证明中，研究者选择dCas13b-ADAR2DD（E488Q）进行进一步表征，并将此方法命名为RNA编辑用于可编程A到I替换版本1（REPAIRv1）。
为了验证荧光素酶活性的恢复是由于真实的编辑事件，研究者通过逆转录和靶向下一代测序直接测量了REPAIRv1介导的Cluc转录物编辑。研究者测试了目标部位周围的30和50 nt间隔物，发现两种引导长度都产生了预期的A到I编辑，50 nt间隔器实现了更高的编辑百分比（图2D，E，图S4C）。研究者还观察到，50个nt间隔物在测序窗口内的非靶向腺苷处编辑的倾向增加，这可能是由于双链RNA的区域增加（图2E，图S4C）。
接下来，研究者将靶向内源性基因PPIB。研究者设计了50个nt间隔物平铺PPIB，并发现研究者可以以高达28%的编辑效率编辑PPIB转录物（图S4D）。为了测试REPAIR是否可以进一步优化，研究者修改了dCas13b和ADAR2DD（E488Q）之间的连接子（图S4E，补充表3），并发现连接子的选择适度影响了荧光素酶活性的恢复。此外，研究者测试了dCas13b和guide单独介导编辑事件的能力，发现编辑需要ADAR脱氨酶结构域（图S5A–D）。
定义RNA编辑序列
考虑到研究者可以在测试点实现精确的RNA编辑，研究者想描述针对转录组中任何RNA靶点编程系统的序列约束。序列限制可能来自dCas13b靶向限制，如PFS，或ADAR序列偏好（28）。为了研究对REPAIRv1的PFS限制，研究者设计了一个质粒库，在Cluc转录物的靶位点的5'端携带一系列四个随机核苷酸（图3A）。研究者以UAG或AAC基序中的中心腺苷为目标，发现对于这两个基序，所有PFS都显示出可检测到的RNA编辑水平，大多数PFS在目标位点的编辑率超过50%（图3B）。接下来，研究者试图确定REPAIRv1中的ADAR2DD是否有任何序列限制直接位于目标碱基的侧翼，如先前关于ADAR2DD的报道（28）。研究者测试了直接围绕靶腺苷的5'和3'侧翼核苷酸的每种可能组合（图3C），并发现REPAIRv1能够编辑所有基序（图3D）。最后，研究者分析了间隔序列中与靶A相对的碱基的身份是否影响了编辑效率，并发现A–C错配具有最高的荧光素酶恢复，与先前关于ADAR2活性的报道一致，其中A–G、A–U和A-A显著降低了REPAIRv1活性（图S5E）。
使用REPAIRv1纠正与疾病相关的人类突变
为了证明REPAIRv1系统在哺乳动物细胞RNA编辑中的广泛适用性，研究者设计了针对两种疾病相关突变的REPAIRv1指南：X连锁肾病性尿崩症中的878G>A（AVPR2 W293X）和范科尼贫血中的1517G>A（FANCC W506X）。研究者将携带这些突变的基因的cDNA表达构建体转染到HEK293FT细胞中，并测试REPAIRv1是否能纠正突变。使用含有50个nt间隔物的引导RNA，研究者能够实现AVPR2的35%校正和FANCC的23%校正（图4A–D）。然后，研究者测试了REPAIRv1纠正34种不同疾病相关G>A突变的能力（补充表4），发现研究者能够在33个位点实现显著编辑，编辑效率高达28%（图4E）。研究者选择的突变只是ClinVar数据库中致病性G到a突变（5739）的一部分，其中还包括额外的11943个G到a变体（图4F和图S6）。由于没有序列限制（图3），REPAIRv1能够潜在地编辑所有这些与疾病相关的突变，特别是考虑到研究者观察到的编辑与目标基序无关（图3C和图4G）。
向患病细胞递送REPAIRv1系统是治疗用途的先决条件，因此研究者寻求设计可包装成治疗相关病毒载体（如腺相关病毒（AAV）载体）的REPAIRv1构建体。AAV载体的包装极限为4.7kb，不能容纳大尺寸的dCas13b-ADARDD（4473bp）以及启动子和表达调控元件。为了减小尺寸，研究者测试了与ADAR2DD（E488Q）融合的dCas13的各种N端和C端截短片段的RNA编辑活性。研究者发现，所有测试的C端截短仍然具有功能，能够恢复荧光素酶信号（图S7），最大的截短，C端Δ984-1090（融合蛋白4152bp的总大小）足够小，足以适合AAV载体的包装限制。
REPAIRv1的转录组特异性
尽管在研究者的荧光素酶平铺实验中，用PspCas13b敲除RNA具有高度特异性，但研究者在指南中观察到脱靶腺苷编辑：靶双链（图2E）。为了了解这是否是一种普遍现象，研究者平铺了内源性转录物KRAS，并测量了靶腺苷附近的脱靶编辑程度（图5A）。研究者发现，对于KRAS，虽然目标编辑率为23%，但目标站点周围有许多站点也具有可检测到的A到I编辑（图5B）。
由于在指南：靶双链中观察到了脱靶编辑，研究者最初通过对12.5X覆盖率的所有mRNA进行RNA测序来评估转录组广泛脱靶。在转录组的所有编辑位点中，目标编辑位点的编辑率最高，A到I转换率为89%。研究者还发现，存在大量的a到I偏离目标事件，1732个偏离目标处于目标导向条件，925个偏离目标位于非目标导向条件下，828个偏离靶在目标导向和非目标导向情况下共享（图5C，D）。鉴于目标导向和非目标导向条件之间存在大量重叠的偏离目标，研究者推断偏离目标可能来自ADARDD。为了验证这一假设，研究者重复了Cluc靶向实验，这次比较了REPAIRv1与靶向指南、REPAIRv1和非靶向指南的转录组变化、单独的REPAIRv1或单独的ADARDD（E488Q）（图S8）。研究者在每种情况下都发现了差异表达的基因和脱靶编辑事件（图S8B，C）。有趣的是，ADARDD（E488Q）和所有REPAIRv1脱靶编辑之间的脱靶编辑事件高度重叠，支持REPAIR脱靶编辑由dCas13b独立ADARDD编辑事件驱动的假设（图S8D）。
接下来，研究者试图比较先前描述的两种RNA引导的ADAR系统（图S9A）。第一种利用ADAR2DD与小病毒蛋白λN（ƛN）的融合，λN与BoxB-ƛRNA发夹结合（24）。带有双BoxB-ƛ发夹的引导RNA引导ADAR2DD编辑引导RNA中编码的位点（25）。第二种设计利用全长ADAR2（ADAR2）和带有发夹的引导RNA，ADAR2的双链RNA结合域（dsRBD）识别该发夹（23，26）。研究者分析了这两个系统与REPAIRv1相比的编辑效率，发现BoxB-ADAR2和全长ADAR2系统分别显示了50%和34.5%的编辑率，而REPAIRv1实现了89%的编辑率（图S9B–E）。此外，BoxB和全长ADAR2系统分别在靶向引导条件下创建了1814个和66个观察到的偏离目标，而在REPAIRv1靶向引导情况下创建了2111个偏离目标。值得注意的是，两个基于ADAR2DD的系统（REPAIRv1和BoxB）的所有条件都显示出其偏离目标的高百分比重叠，而全长ADAR2系统具有一组明显不同的偏离目标（图S9F）。靶向和非靶向条件之间以及REPAIRv1和BoxB条件之间的偏离目标重叠表明ADAR2DD独立于dCas13靶向驱动偏离目标（图S9F）。
通过合理的蛋白质工程提高修复的特异性
为了提高REPAIRv1的特异性，研究者采用了ADAR2DD（E488Q）的结构导向蛋白工程。由于非靶点的指南独立性，研究者假设破坏ADAR2DD（E488Q）-RNA结合的稳定性将选择性地减少非靶点编辑，但由于ADAR2DD的dCas13b系链（E488Q）到靶位点的局部浓度增加，因此维持靶点编辑。研究者突变了ADAR2DD（E488Q）中的残基，之前确定其与靶RNA的双链区接触（图6A）（19）。为了评估效率和特异性，研究者使用靶向和非靶向指南测试了17个单突变体，假设在非靶向条件下背景荧光素酶恢复将指示更广泛的脱靶活性。研究者发现，所选残基处的突变对靶向和非靶向指南的荧光素酶活性有显著影响（图6A，B，图S10A）。大多数突变体要么显著提高了靶向导向物的荧光素酶活性，要么增加了靶向与非靶向导向活性的比率，研究者称之为特异性得分（图6A，B）。
研究者选择了这些突变体的一个子集（图6B），通过下一代测序进行转录组范围的特异性分析。正如预期的，从转录组范围测序测量的非靶点与研究者的突变体特异性得分相关（图S10B）。研究者发现，除ADAR2DD（E488Q/R455E）外，所有测序的REPAIRv1突变体都可以有效编辑报告转录本（图6C），许多突变体显示出非靶点数量的减少（图6CC，图S10C，S11）。研究者进一步探索了各种特异性突变体的脱靶周围基序，发现REPAIRv1和大多数工程变体对其脱靶编辑表现出强烈的3'G偏好，与特征化的ADAR2基序一致（图S12A）（28）。
研究者重点关注了突变体ADAR2DD（E488Q/T375G），因为它在四个转录组广泛靶点数量最少的突变体中具有最高的编辑百分比，并将其称为REPAIRv2。与REPAIRv1相比，REPAIRv2表现出更强的特异性，通过高覆盖测序（125X覆盖率，10ng DNA转染），转录组广泛目标从18385个减少到20个（图6D）。在Cluc中靶向腺苷周围的区域，REPAIRv2也减少了脱靶编辑，在测序痕迹中可见（图6E）。在源自非目标位点的图案中，REPAIRv1表现出对3'G的强烈偏好，但显示出对所有图案的目标编辑（图S12B）；相比之下，REPAIRv2仅编辑了最强的偏离目标图案（图S12C）。REPAIRv1的转录本编辑分布严重扭曲，高度编辑的基因有超过60个编辑（图S13A），而REPAIRv2只多次编辑一个转录本（EEF1A1）（图S13B）。REPAIRv1脱靶编辑被预测会导致多种变体，包括1000个错义碱基改变（图S13C），93个与癌症过程相关的基因事件（图S13D）。相比之下，REPAIRv2只有6个预测的碱基变化（图S10E），其中没有一个在癌症相关基因中（图S13F）。对围绕REPAIRv1或v2的脱靶编辑的序列的分析没有揭示与指南序列的同源性，表明脱靶可能是dCas13b独立的（图S14），与REPAIRv1和ADAR脱氨酶结构域之间的脱靶高度重叠一致（图S8D）。为了直接将REPAIRv2与其他可编程ADAR系统进行比较，研究者在两种不同剂量的ADAR载体下对所有系统重复了研究者的Cluc靶向实验，发现REPAIRv2具有与BoxB和ADAR2相当的靶向编辑，但在两种剂量下，脱靶编辑事件显著减少（图S15）。与两种剂量的REPAIRv1相比，REPAIRv2具有更强的特异性（图S15B），这一发现也扩展到针对PPIB上不同位点的两种指南（图S16A-D）。还值得注意的是，一般而言，较低剂量条件（10ng）的偏离目标比较高剂量条件（150ng）的少（图S5）。
为了以更高的灵敏度评估编辑特异性，研究者在显著更高的测序深度（转录组的125X覆盖率）对REPAIRv1和v2的低剂量条件（10ng转染DNA）进行了测序。在与检测到更罕见的脱靶事件相对应的更高测序深度处发现了更多的脱靶（图S17）。此外，研究者推测，不同的转录组状态也可能改变脱靶事件的数量。因此，研究者测试了骨肉瘤U2OS细胞系中的REPAIRv2活性，分别观察了靶向和非靶向导向的6个和7个非靶向（图S18）。
研究者将REPAIRv2靶向内源性基因，以测试特异性增强突变是否减少了靶转录物中的附近编辑，同时保持了高效的靶编辑。对于靶向KRAS或PPIB的指南，研究者发现，与REPAIRv1不同，REPAIRv2没有可检测到的脱靶编辑，并且可以有效地编辑目标腺苷，效率为27.1%（KRAS）或13%（PPIB）（图6F）。这种特异性扩展到其他靶位点，包括在REPAIRv1的非靶向条件下表现出高水平背景的区域，例如其他KRAS或PPIB靶位点（图S19）。总的来说，REPAIRv2消除了编辑腺苷周围双链区的脱靶，并显示出显著增强的转录组特异性。
