影响因子：19.568
发表时间：2023年2月4日
研究方法：m5C MeRIP-seq、m5C Bis-seq、RNA-seq、LC-MS/MS
文章链接：NSUN2-mediated M5c methylation of IRF3 mRNA negatively regulates type I interferon responses during various viral infections
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研究内容
1、NSUN2负调控I型干扰素反应
为了探索参与I型干扰素反应的RNA甲基转移酶或去甲基化酶的功能，文章使用小干扰RNA（siRNAs）敲除HEK293T细胞中不同的RNA甲基转移酶或去甲基化酶，并检测内源性IFNB1 mRNA水平。qPCR结果发现，NSUN2的敲除可以更显著地提高内源性IFNB1 mRNA水平（图1a）。为了证实NSUN2对I型干扰素反应的影响，文章检测了外源性NSUN2的表达，发现它可以以剂量依赖性的方式抑制仙台病毒（SeV）诱导的IFN-β启动子活性的激活（图1b）。外源性NSUN2的表达也可以抑制不同刺激物诱导的IFN-β启动子活性的激活（图1c）。在NSUN2敲低的HEK293T细胞中，SeV诱导的内源性IFNB1 mRNA水平的增加显著增加，下游的ISG15和CXCL10的mRNA水平也显著增加（图1d）。SeV诱导的I型干扰素反应在NSUN2敲除的HEK293T细胞中也显著增强(图1e)。此外，NSUN2的敲除也促进了SeV诱导的I型干扰素对HeLa、THP-1、骨髓来源树突状细胞（BMDCs）和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的I型干扰素反应（图1f，g）。在SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞中，敲除NSUN2持续促进了I型干扰素应答，这表明NSUN2在SARS-CoV-2感染中也发挥了重要的调控作用（图1h）。
接下来，文章继续研究了NSUN2是否参与了水疱性口炎病毒（VSV）感染期间的抗病毒应答。在HEK293T中敲除NSUN2显著抑制了携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因（VSV-GFP）的VSV的复制（图1i），鲁索利替尼可以增强VSV对NSUN2敲除细胞中增殖的抑制作用（图1j）。此外，敲除NSUN2抑制了SeV、VSV和单纯疱疹病毒1（HSV-1）在A549野生型细胞中的增殖，但在A549IFNAR1−/−细胞中没有增殖（图1k）。为了进一步研究NSUN2在病毒感染过程中的生物学作用，文章观察到在SeV或寨卡病毒（ZIKV）感染后，NSUN2 mRNA随着时间的推移而减少，这揭示了NSUN2在病毒感染过程中的潜在功能（图1m）。值得注意的是，文章发现SARS-CoV-2感染也可以显著降低Caco-2细胞中的NSUN2 mRNA水平（图1n）。因此，文章进一步对从2例covid-19患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离的RNA进行了RNA-seq。结果发现与健康人相比，COVID-19患者的NSUN2 mRNA水平持续降低（图1o)。综上所述，NSUN2可能作为I型干扰素应答的负调控因子，在包括SARSCoV-2在内的不同病毒感染期间，NSUN2的表达显著降低，以增强抗病毒I型干扰素应答。
图1 NSUN2负调控抗病毒先天I型干扰素应答
2、NSUN2通过调节IRF3的表达水平来抑制I型干扰素反应
文章发现外源性NSUN2的表达显著抑制了上游激活物诱导的PRDIIII-luc活性（图2a），而抑制NSUN2有相反的效果（图2b）。由于IRF3是I型干扰素应答启动过程中的最终因素，文章推测NSUN2可能在IRF3节点上发挥其功能。免疫印迹分析显示，外源性NSUN2表达可以抑制内源性IRF3水平增强（2c），相比之下，内源性TBK1蛋白水平没有明显变化。此外，敲除NSUN2促进了IRF3 Ser396的磷酸化水平，对TBK1 Ser172的磷酸化水平则无促进效果（图2e，f）。这些结果表明，NSUN2的缺失可以提高IRF3蛋白的整体水平及其磷酸化水平。qPCR分析结果显示IRF3是NSUN2调控干扰素反应的主要下游靶点（图2g）。因此，文章进一步使用IRF3−/−Irf7−/−mef，将NSUN2和IRF3-FL与VSV或HSV-1感染共转染，发现NSUN2对病毒繁殖的促进依赖于IRF3的存在（图2h）。综上所述，这些结果表明，NSUN2可以特异性抑制IRF3的表达，从而负调控病毒感染后的I型干扰素应答。
图2.NSUN2抑制IRF3的表达水平
3、NSUN2催化IRF3 mRNA的m5 C甲基化
文章推测NSUN2可能与IRF3 mRNA发生物理上的相互作用。CO-IP和WB结果显示，在HEK293T中，NSUN2和IRF3蛋白之间没有相互作用（图3a）。文章进一步在SeV刺激的HEK293T细胞中过表达并免疫沉淀NSUN2蛋白，并对其进行RNA提取和qPCR。结果显示，NSUN2确实与内源性IRF3 mRNA结合，而内源性TBK1 mRNA不与NSUN2相互作用（图3b），敲除NSUN2提高了内源性IRF3 mRNA水平，而内源性TBK1 mRNA水平没有受到影响(图3c，d）。随后，文章检测了野生型和NSUN2mRNA2−/−HEK293T细胞内源性IRF3 mRNA的半衰期，结果发现，敲除NSUN2显著提高了IRF3 mRNA的半衰期（图3e）。此外，文章使用HA-tag抗体从NSUN2-/- HEK293T中沉淀HA-NSUN2蛋白，并重组外源性HANSUN2（图3f）。综上结果表明，NSUN2主要通过与IRF3 mRNA结合并加速其降解来降低IRF3蛋白水平。
使用重组GST-NSUN2和3h标记的S-腺苷蛋氨酸（SAM）对这些RNA进行体外甲基化分析。与RIG-I、MAVS和TBK1的转录本相比，转录后的IRF3 mRNA可被NSUN2高度甲基化（图4a，b）。这些数据表明，与RIG-I、MAVS和TBK1 mRNA相比，NSUN2可以在体外有效地介导IRF3 mRNA的甲基化。为了确定哪个区域可能被甲基化，文章将IRF3 mRNA分为7个部分（图4a），与其他片段相比，IRF3 5‘UTR、3’UTR、CDS2和CDS3被NSUN2高度甲基化（图4c）。将等量的内源性IRF3 mRNA装载在细胞膜上，并测定m5 C的水平。m5C merip-seq结果显示，NSUN2敲除细胞中IRF3 mRNA的m5 C甲基化水平明显低于野生型细胞（图4d）。m5C meRIP-qPCR的结果显示，NSUN2敲除细胞中内源性m5 C甲基化的IRF3 mRNA水平明显低于野生型细胞，而外源性NSUN2的表达可显著提高内源性m5 C-甲基化的IRF3 mRNA水平（图4e）。随后，文章进一步通过RNA-seq数据分析了过表达NSUN2的HEK293T细胞或HEK293T细胞中mRNA的表达水平。从这些结果来看，在NSUN2过表达的细胞中，IRF3、IFNB1及其下游的ISGs持续下调（图4f），而相应的SeV复制增强（图4g）。然而，上游信号因子如RIG-I（DDX58）、TBK1或MAVS并没有表现出NSUN2的一致或显著调控。这些结果显示，NSUN2介导的IRF3 mRNA的m5 C甲基化调控了IRF3 mRNA水平和IRF3介导的IFNB1和下游ISGs水平（图4d,e）。甲基转移酶突变体C271A能提高NSUN2的催化活性（图4h）。文章利用LC-MS/MS检测了转染了NSUN2或其突变体的NSUN2−/−HEK293T细胞中总RNA（图4i）或mRNA（图4j）的m5 C甲基化水平。如图4(k)所示，与野生型NSUN2相比，I302A或C321A过表达后，SeV诱导-IFN-β荧光素酶检测中部分抑制能力丧失，而C271A与野生型NSUN2相比可增强抑制能力。此外，在NSUN2−/−HEK293T细胞中，双突变体I302A/C321A在功能（图4l）和对IFNB1 mRNA水平的影响（图4m）方面都完全失去了其抑制能力。
RNA-seq的GO分析结果表明敲除NSUN2有助于免疫应答的显著升高，这进一步证明了NSUN2在抗病毒先天免疫应答中的关键作用（图5a）。在A549 NSUN2敲除细胞中，IRF3、IFNB1及其下游ISGs持续上调，而相应的SeV复制受到抑制（图5b，c）。同时，A549 NSUN2敲除细胞中内源性m5 C甲基化IRF3 mRNA水平显著低于A549野生型细胞（图5d）。
图3.NSUN2与IRF3 mRNA相互作用并诱导其降解
图4 NSUN2催化外源性和内源性IRNF3 mRNA m5C甲基化的形成
图5 敲除NSUN2降低了IRF3 mRNA上的m5 C甲基化，但增加了IRF3和IFNB1以及下游ISGs mRNA水平
4、IRF3 mRNA的甲基化胞嘧啶调节RNA水平
m5C MeRIP-seq转录组分析发现了未感染或sars-cov-2感染的Caco-2细胞中RNA的内源性m5C位点（图6a）。m5C Bis-seq分析发现（图6b），IRF3 mRNA中的一个甲基化胞嘧啶是甲基化的主要位点，在体外被重组NSUN2蛋白高度甲基化：5‘UTR中的C169（图6c）。此外，还发现了另外三个高度甲基化的胞嘧啶：3‘UTR中的C1569，CDS2中的C556（486-735），CDS3中的C815（736-985），与在IRF3 mRNA中观察到的四个高甲基化区域一致(图4c ）。进一步研究NSUN2对IRF3 mRNA的m5 C甲基化的生物学功能，如图6(d)所示，敲除NSUN2可以增加报告基因pGL3-IRF3-5‘UTR、pGL3-IRF3-CDS和pGL3- IRF3-3’UTR的荧光素酶活性。在5‘UTR中观察到突变C169（C到G），在3‘UTR中观察到突变C1569（C到G），CDS2（486-735）的C556（C到T，同义突变）和CDS3（736-985）的C815（C到A，同义突变），这四个突变位点在重组NSUN2中的甲基化水平降低了一半。随后，文章构建了包含野生型IRF3全长（IRF3-fl，1-1595nt）或不同位点突变的IRF3- FLs的表达质粒。发现与野生型IRF3全长（IRF3-FL-WT）相比，这4个胞嘧啶的突变可以持续提高IRF3−/−Irf7−/−mef中IRF3 mRNA的表达水平(图6f）。位于CDS1（C303）或CDS4（C1135）中的另外两个胞嘧啶（图6a）在m5C Bis-seq中未被检测到，并且对其功能没有影响（图6f和g）。综上所述，研究结果表明，m5C修改的损失可能导致IRF3 mRNA的稳定性和增强IFN-β生产，从而促进更强的抗病毒反应，而IRF3 mRNA高度甲基化胞嘧啶在Nsun2介导的抗病毒反应发挥关键作用。
图6.IRF3 m5 C甲基化位点突变导致IRF3表达增强和抗病毒应答
5、NSUN2在体内诱导I型干扰素和抗病毒应答中的关键作用
Nsun2+/−小鼠中Nsun2的表达比野生型同窝小鼠减少了一半（图7a，b），在感染SeV后，Nsun2+/−小鼠的BMDCs中内源性IRF3mRNA水平和蛋白水平均比野生型同窝小鼠中增强（图7a，b）。此外，如图7(c)所示，与使用SeV、HSV-1或VSV的野生型小鼠相比，Nsun2+/−小鼠的BMDCs中Ifnb1 mRNA水平显著提高了。IFN-β介导的下游Isg15和Cxcl10在Nsun2+/−小鼠的BMDCs中也显著增强（图7d）。因此，在Nsun2+/−小鼠的BMDCs中，SeV、HSV-1或VSV明显受到抑制（图7e）。来自Nsun2+/−小鼠或Nsun2+/+小鼠的BMDCs的RNA-seq结果表明，在Nsun2+/−小鼠的BMDCs中，Irf3、Ifnb1和下游ISGs持续升高（图7f）。同时，Nsun2+/−小鼠相比于Nsun2+/+小鼠，BMDCs中内源性m5 C甲基化的Irf3 mRNA水平更低（图7g）。然而，mRNA上Rig-i、Tbk1或Mavs没有显著的m5 C修饰信号。在Nsun2+/−小鼠的BMDCs中，内源性IRF3 mRNA的稳定性更高（图7h）。随后，文章研究了野生型小鼠和Nsun2+/−小鼠的先天抗病毒应答。结果发现，在mRNA水平上，相比于野生型小鼠，Nsun2+/−小鼠不同器官中的IFN-β产量更高，VSV的病毒负荷更低（图7i）。并且在ELISA腹腔注射VSV后，Nsun2+/−小鼠的血清中IFN-β和IFN-α的产生显著升高（图7j）。此外，文章还比较了腹腔注射VSV后的生存率。结果表明，野生型小鼠比Nsun2+/−小鼠更容易发生VSV触发的死亡（图7k）。
文章进一步研究了SARSCoV-2感染的K18-hACE2基因敲入（KI）小鼠模型的先天免疫应答和NSUN2的表达水平。研究发现SARS-CoV-2 WT菌株（图8a）或BA.1 omicron变异（图8b）激活了K18-hACE2 KI小鼠模型中的先天免疫反应。SARS-CoV-2 WT菌株或BA的内源性Nsun2 mRNA水平显著降低。与未感染组相比，有1个omicron变异感染组（图8a和b）。这些结果与SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞模型和COVID-19患者相一致，共同表明NSUN2在SARS-CoV-2感染中起着重要的调控作用（图1n和o）。
图7.NSUN2在体内诱导I型干扰素和抗病毒应答中的关键作用
图8.SARS-CoV-2感染降低了K18-hACE2 KI小鼠的Nsun2表达水平，并激活了先天免疫应答
总 结
本研究通过m5C MeRIP-seq、RNA-seq、m5C Bis-seq等多种技术的联合分析，发现在病毒感染过程中，内源性NSUN2的表达水平降低，因此IRF3 mRNA的m5 C修饰水平降低，但稳定性增加。因此，IRF3的表达水平提高，允许更强的干扰素反应和有效的消除病毒。这种重要的宿主抗病毒策略来调节干扰素反应的进化表明，NSUN2介导的m5 C修饰具有重要的生理意义。
云序生物m5C甲基化研究五大模块
01 m5C RNA甲基化测序m5C RNA甲基化测序（m5C-seq）
对m5C RNA甲基化，目前流行的检测手段为m5C-Seq技术，适用于m5C RNA甲基化谱研究，快速筛选m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m5C测序：
m5C 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
m5C LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
m5C Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
m5C mRNA测序
02 检测整体m5C RNA甲基化水平
LC-MS/MS检测整体RNA甲基化水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
03 m5CRNA甲基化上游酶的筛选
m5CRNA甲基化相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m5C RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m5C RNA甲基化靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05 机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
云序生物服务优势
优势一：云序累计支持客户发表 100 + 篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子 960 +优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：可检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：提供m5C一站式服务：m5C整体水平检测、m5C-seq、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：提供多种 RNA 修饰测序服务，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
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